下丘脑-腺垂体-性腺轴对基因修饰鼠所致性别相关心血管表型差异的影响及其机制研究

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1、分类号：密级：ＵＤＣ：学号：３５５６２８８１２０２０南昌大学博士研究生学位论文下丘脑－腺垂体－性腺轴对基因修饰鼠所致性别相关心血管表型差异的影响及其机制研究ＥｆｆｅｃｔｓａｎｄＭｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｔｈｅＨｏｔｈａｌａｍｉｃＰｉｔｕｉｔａｒＧｏｎａｄａｌｙｐｙＡｘｉｓｏｎＧｅｎｄｅｒＲｅｌａｔｅｄＣａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒＰｈｅｎｏｔｙｐｅｓｗｉｔｈＧｅｎｅｔｉｃａｌｌＭｏｄｉｆｉｅｄＭｉｃｅｙ肖云飞培养单位（院、系）：生命科学学院指导教师

2、姓名、职称：辛洪波教授申请学位的学科门类：理学学科专业名称：生物学论文答辩日期：２０１６年１２月答辩委员会主席：评阅人２０１６年１２月摘要摘要研究背景及研究目的：大量临床观察和基因修饰动物模型资料显示，心血管表型具有显著的性别差异。一般认为，雌激素对心血管系统具有保护作用，而雄激素则可加重心血管系统的损伤。然而，在对妇女绝经后综合征进行大规模激素替代疗法的临床观察表明，雌激素替代疗法不仅可导致体内激素水平失衡，同时还有增加心血管疾病以及女性肿瘤的风险。目前，对这种不同性别所致的心血管表型差

3、异的分子机制研究仅限于性激素对靶器官的作用，其分子机制还远未阐明。我们曾发现FKBP12.6基因敲除（FKBP12.6-/-）后仅雄性小鼠发生心肌肥大，CD38基因敲除（CD38-/-）后仅雄性小鼠心功能增强，我们还观察到CD38-/-小鼠血清睾酮，雌二醇和LH水平上调。我们推测FKBP12.6和CD38基因修饰可能通过上调了中枢下丘脑-腺垂体-性腺轴（hypothalamic-pituitary-gonadalaxis:HPGs）而发挥作用，但具体机制还不明确。因此，我们提出假说：各种原因导致的HPGs激活是引起性

4、别相关心血管表型差异的主要原因。本研究旨在以FKBP12.6和CD38基因敲除小鼠作为基因修饰动物模型，深入探讨下丘脑-腺垂体-性腺轴对基因修饰小鼠所致心血管表型差异的调控作用及其机制，同时，我们以新近制备的Tet-on诱导性下丘脑特异性表达GnRH1转基因小鼠验证我们的假说。实验方法：1.为了明确FKBP12.6缺失对心脏的直接作用，我们首先检测FKBP12.6-/-小鼠心脏钙离子相关通路蛋白CaMKⅡ和Calcineurin(CaN)、MCIP1、MCIP1.4、雄激素受体和雌激素受体的表达变化。2.为了明确性激

5、素在雄性FKBP12.6-/-小鼠心肌肥大中的作用，我们首先将雄性小鼠睾丸摘除观察小鼠心脏体重比变化。同时采用放免法(RIA)和ELISA法检测FKBP12.6-/-小鼠睾酮、雌二醇、LH和FSH分泌水平。3.为了明确FKBP12.6-/-对HPGs的调控部位，我们采用RT-QPCR和westernblot法比较了垂体神经元细胞LβT2和下丘脑神经元细胞GT1-7中FKBP12.6的表达，观察FKBP12.6干扰后GT1-7细胞中GnRH1的表达变化和LβT2细胞中LHβ、Nur77、SF-1的表达变化。同时采用Fl

6、uo-3钙离子探针检测LβT2I摘要细胞内钙离子浓度变化，最后westernblot检测LβT2细胞胞浆胞核中CaN/NFAT通路相关蛋白的表达变化（ERK1/2、CaN、MCIP1.4Nur77、NFAT3、Pin1）。4.Sirt1被证明可调控HPGs的功能，为了明确Sirt1在CD38-/-小鼠下丘脑中的作用机制，我们采用RT-PCR和westernblot检测GT1-7细胞中CD38干扰并加入Sirt1抑制剂EX527后，Sirt1、Ac-P53、GnRH1及其转录因子Otx2的蛋白表达变化。5.为了验证我们

7、的假说，即各种原因导致的HPGs激活是引起性别相关的心血管表型差异的主要原因，我们制备了Tet-on诱导性下丘脑特异性GnRH1转基因小鼠。当小鼠成年后给予DOX可诱导小鼠下丘脑特异性GnRH1过表达；免疫荧光染色和westernblot检测GnRH1在转基因小鼠下丘脑中的表达。小动物超声仪检测不同性别小鼠心功能变化，westernblot法检测雄激素促心肌肥大通路mTOR的磷酸化水平。实验结果：1.FKBP12.6-/-小鼠心脏蛋白检测结果表明，CaMKⅡ的磷酸化水平与野生型小鼠无差异，雄性小鼠MCIP1.4表达上

8、调，雌性小鼠MCIP1表达上调，表明雄性小鼠CaN活性增强，雌性小鼠CaN活性被抑制。2.FKBP12.6-/-雄性小鼠睾丸摘除后不发生心肌肥大，表明雄激素在雄性FKBP12.6-/-小鼠心肌肥大中起重要作用。FKBP12.6-/-敲除小鼠性激素水平上调。表明FKBP12.6-/-敲除小鼠下丘脑-腺垂体-性腺轴功能上调。3.FKBP12.6在L