逆转录微滴数字PCR技术检测蔬果中GⅠ型及GⅡ型诺如病毒

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1、暨南大学硕士学位论文题名（中英对照）：逆转录微滴数字PCR技术检测蔬果中GI型及GII型诺如病毒ThedetectionofNorovirusGIandGIIinlettuceandstrawberrywithRT-ddPCR作者姓名：陈嘉茵指导教师姓名及学位、职称：吴希阳博士教授学科、专业名称：粮食、油脂及植物蛋白工程论文提交日期：论文答辩日期：答辩委员会主席：论文评阅人：（盲审）学位授予单位和日期：独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过

2、的研究成果，也不包含为获得暨南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解暨南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权暨南大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期

3、：年月日学位论文作者毕业后去向：工作单位：电话：通讯地址：摘要在世界范围内，有大于50%的急性肠胃炎事件是由诺如病毒所造成。它主要传播途径为“粪--口”传播，常受到污染的食品有蔬菜，软质水果，贝类等。目前反转录荧光定量PCR（qPCR）法是现今检测诺如病毒的“金标准”，然而在qPCR检测中，若样品存在PCR抑制物，则会降低其灵敏度和准确性，易造成假阴性。同时qPCR法需要依赖Ct值和标准曲线的准确性才能对样品进行定量分析，存在一定的不确定性，难以检测微小的拷贝数变化，灵敏度有限也是qPCR的一个缺点。鉴于诺如病毒是一种高感染性病毒，在食品中的病毒量通常偏

4、低，因此为了提高对诺如病毒检测的灵敏度，本研究采用微滴数字PCR仪，建立一步法检测食品中诺如病毒GI型及GII型的方法（RT-ddPCR），对果蔬食品中低含量的诺如病毒进行检测，并与现有的qPCR检测标准方法所得结果进行对比。研究结果如下：1.采取应用在qPCR方法上的诺如病毒GI型及诺如病毒GII型的引物对及探针，通过优化退火温度及引物、探针浓度，建立诺如病毒GI型及GII型的RT-ddPCR检测体系。同时通过构建的阳性质粒，确定RT-ddPCR的检测范围。利用其他常见的肠道病毒核酸（非诺如病毒）作为反应模板，与诺如病毒同时进行RT-ddPCR反应，判

5、定反应体系的特异性，并通过不同时间多次检测样品的方式判断该检测方法的稳定性。结果发现，一步法RT-ddPCR的诺如病毒GI型最高检测限为4.86×104copies/μL，最低检测限为4.86copies/μL，标准曲线相关系数可达0.996；构建的检测诺如病毒GII型的体系最高检测限为8.47×104copies/μL，最低检测限为8.47copies/μL，标准曲线相关系数达0.997。以上两种方法特异性良好，稳定性测试显示组间CV小于3%，说明具有良好的重复性。2.在已建立的独立的一步法微滴数字PCR检测诺如病毒的体系基础上，研究开发双重微滴数字P

6、CR同时检测诺如病毒GI型和GII型的体系。结果显示：该方法的灵敏度与单重的相近，可检测到个位拷贝数目的目标核酸，且能在混合核酸中检测出对应的目标病毒核酸，说明具有良好的特异性及准确性。其组间CV小于5%，具有良好的稳定性。3.采取人工染毒方式对生菜及草莓进行了不同浓度（高、中、低）的染毒，通过对比染毒样品RNA提取过程去除PCR反应抑制剂前后在qPCR及RT-ddPCR上的检测结果，发现RT-ddPCR更能规避样品中PCR抑制剂不利影响，且RT-ddPCRI比起qPCR更能有效检测出低浓度下的病毒核酸。在低染毒浓度情况下，生菜NoVGI及NoVGII的

7、检测结果显示，RT-ddPCR比起qPCR至少能检测出2倍以上的病毒核酸浓度。其在未去除抑制物的情况下平均病毒回收率分别超过30%及10%，均高于去除抑制物后的qPCR检测结果（NoVGI：26.21%，NoVGII：9.71%）。对于物质组成更为复杂的草莓，RT-ddPCR及qPCR检测结果在去除抑制物后病毒回收率均有一定程度上的提升。在NoVGII的低染毒条件下，未经纯化的样品不能被qPCR检出，却能被RT-ddPCR检测。RT-ddPCR比起同处理条件下的qPCR检测计算出的病毒回收率高3.21%~5.16%（NoVGI）及8.53%~9.41%（

8、NoVGII）。优化病毒富集方法后，在低染毒的双重qPCR检测情况中发现，NoV