邻苯二甲酸二丁酯（DBP）水解酶基因的克隆与功能分析

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1、暨南大学硕士学位论文题名（中英对照）：邻苯二甲酸二丁酯（DBP）水解酶基因的克隆与功能分析CloningandfunctionalanalysisofadibutylphthalatehydrolasegenefromRhodococcussp.2G作者姓名：胡瑞文指导教师姓名及学位、职称：蔡全英、博士、教授学科、专业名称：工学、环境工程学位类型：专业学位论文提交日期：2018年4月2日论文答辩日期：2018年6月2日答辩委员会主席：论文评阅人：学位授予单位和日期：暨南大学硕士学位论文摘要随着全球工业化进

2、程的不断向前推进，塑料制品产量居高不下。邻苯二甲酸酯（Phthalicacidesters，PAEs）作为塑料制品中重要的添加剂，随着塑料制品的大量使用而残留于环境中并引发环境污染。而且，PAEs是一类典型的内分泌干扰物，部分具有致癌、致畸、致突变效应，可通过食物链传递进入人体，危害人体健康。邻苯二甲酸二丁酯（DBP）是一种常见的PAEs化合物，因其在环境介质中普遍检出，毒性危害严重，被多个国家或组织列为优先控制污染物。因此，如何有效控制和消除环境中的PAEs污染已成为当务之急。目前，微生物降解因成本低廉

3、、有效、无二次污染等特点，已成为PAEs污染修复的重要手段之一。但关于PAEs微生物降解分子机理方面的研究还很薄弱，这在很大程度上影响了降解菌对环境污染修复功能的应用。本文以DBP为目标污染物，选取课题组前期筛选得到的PAEs降解菌Rhodococcussp.2G为研究对象，通过构建基因组文库筛选克隆获得了DBP水解酶基因，经外源蛋白表达与纯化，研究了DBP水解酶的酶学性质；采用光谱学手段结合分子模拟对接技术，研究DBP与水解酶的结合特性以及水解酶构象的变化，揭示了DBP与水解酶的结合机理。本研究不仅为完

4、整阐述PAEs微生物降解分子机理提供理论基础，还为高效降解工程菌的构建与应用提供基因资源。主要研究结果如下：(1)基因组文库的构建：为获取DBP水解酶基因，构建了降解菌Rhodococcussp.2G的基因组文库。在所构建的基因组文库中大约产生了18000个转化子，通过三步筛选法获得一个具有DBP降解活性的阳性转化子，将其命名为2G-I。对其重组质粒中插入的基因片段测序与分析得出，该基因片段大小为795bp，且具有一个ORF，与Rhodococcussp.2G全基因组测序结果中的α/β-水解酶基因中的OR

5、F相似度高达100%，将其命名为Hyd基因。(2)Hyd基因生物信息学分析：运用生物信息学软件，由Hyd基因推断出Hyd蛋白氨基酸序列，经过蛋白家族和保守结构域查询表明，Hyd蛋白属于α/β-水解酶家族，是α/β-水解酶（CL0028）中的PF00561成员，具有典型的α/β-水解酶超家族结构。此外Hyd蛋白的一级、二级结构预测表明Hyd蛋白是由264个氨基酸组成，分子式为C1289H2015N367O372S6；分子量（M）为28.79kDa，等电点（pI）5.27；且蛋白二级结构中α-螺旋、β-折叠以

6、及无规则卷曲的含量分别为42.5%，16.67%和41.29%。(3)Hyd基因原核表达与纯化以及酶学性质研究：重组Hyd蛋白在温度为20℃条件下，经0.5mmol/LIPTG过夜诱导实现了高水平表达，SDS-PAGE分析显示在35kDa处出现了I暨南大学硕士学位论文特异表达的蛋白条带，表达蛋白经纯化和WesternBlot验证为诱导表达的特异蛋白。当DBP浓度为27.83mg/L，0.1mgHyd蛋白在5min内对DBP的降解率可达65%；Hyd蛋白最适反应温度为37℃，在20-50℃的温度范围内可有效

7、降解DBP；最适反应pH为7.5，在pH=6.0-8.0内均可有效降解DBP。(4)DBP与Hyd蛋白的作用机制：采用荧光光谱法和分子模拟对接技术测定了DBP与Hyd蛋白的相互作用模式，结果表明：DBP分子嵌插入由Leu29、Ser93、Phe94、Ala97、Pro118、Ile120、Pro123、Ile130、Thr190、Ser191、Trp192等氨基酸残基构成的疏水性空腔之中，通过与Hyd蛋白结合结合形成基态复合物而猝灭Hyd蛋白的内源荧光；DBP不仅与疏水性氨基酸Leu29、Ala97、Il

8、e120、Ile130、Trp192等发生疏水性作用。同时，DBP分子还与Thr190、Ser191形成两个氢键，键长分别为2.0Å和2.1Å。此外，紫外−可见吸收光谱、同步荧光光谱、圆二色谱分析表明，DBP在与Hyd蛋白结合的过程中，DBP对Hyd蛋白的构象造成影响，导致Hyd蛋白二级结构中的α-螺旋含量降低，表明DBP与Hyd蛋白多肽主链的氨基酸发生结合，引起多肽链的重排和结构变化，多肽链部分伸展导致某些疏水区域被暴露，进