集胞藻PCC6803中S2P蛋白酶参与胁迫响应的功能研究

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1、硕士学位论文集胞藻PCC6803中S2P蛋白酶参与胁迫响应的功能研究作者姓名刘小芳学科专业制糖工程指导教师陈谷教授所在学院食品科学与工程学院论文提交日期2018年6月FunctionalCharacterizationoftheS2PProteasesinSynechocystissp.PCC6803underStressResponseADissertationSubmittedfortheDegreeofMasterCandidate：LiuXiaofangSupervisor：Prof.ChenGuSouthChina

2、UniversityofTechnologyGuangzhou,China类号：学校代号：10561学号：201520119856华南理工大学硕士学位论文集胞藻PCC6803中S2P蛋白酶参与胁迫响应的功能研究作者姓名：刘小芳指导教师姓名、职称：陈谷教授申请学位级别：学术型硕士学科专业名称：制糖工程研究方向：功能基因论文提交日期：2018年6月7日论文答辩日期：2018年6月4日学位授予单位：华南理工大学学位授予日期：年月日答辩委员会成员：主席：蔡俊鹏教授委员：张学武教授魏东教授陈谷教授范晓丹副教授摘要随着社会迅速发展，能源

3、需求不断增多，新型能源的开发日渐重要。微藻用于生物质能源的开发和利用成为解决能源不足问题的重要途径，但是将微藻应用于能源的研发需要解决的重要问题是能源累积过程产生的胁迫压力会对细胞的生长带来影响。集胞藻PCC6803有着独特的生理特性，是研究非生物胁迫的模式生物，也可应用于生物质能源的开发。集胞藻中S2P蛋白酶调控的膜内蛋白水解机制被认为是潜在的外界信号接收和传导机制，推测其参与激活胁迫响应相关基因的表达。研究集胞藻中S2P蛋白酶在胁迫响应中的调控机制，不但可以为研究生物适应环境胁迫提供理论依据，也可以为开发耐受胁迫的工程藻

4、奠定基础。集胞藻PCC6803有4个S2P同源蛋白酶，本论文研究其中的两个，Sll0528和Slr0643。通过构建Sll0528的过表达突变体OE0528，与其缺失突变株Δsll0528，一起探究Sll0528在集胞藻响应多种非生物胁迫中的功能；同时通过分析Slr0643敲除突变体Δslr0643在葡萄糖混养胁迫下的转录组数据，探究Slr0643参与集胞藻适应混养的机制。具体研究内容和结果如下：r（1）构建重组质粒，通过同源重组法将重组质粒中的过表达元件km+psbA2promoter+sll0528转化入集胞藻slr20

5、30和slr2031间中性位点，构建sll0528过表达突变体藻株OE0528。最后得到6株过表达突变体藻株OE0528，RT-qPCR实验结果显示，sll0528表达水平明显高于野生型。正常生理条件下，突变体OE0528和野生型生长情况基本一致，表明过表达sll0528对集胞藻生长没有影响。（2）对已经构建好的Sll0528敲除突变体Δsll0528和本次构建的过表达突变体OE0528进行铵盐胁迫实验。Δsll0528在120mM氯化铵下生长受到阻碍，叶绿素和藻胆蛋白含量均低于野生型；OE0528在180mM氯化铵下生长趋

6、势明显优于野生型，叶绿素和藻胆蛋白含量也高于野生型。sll0528缺失突变株Δsll0528，在120mM氯化铵下光合系统受损，可能是其不能生长的原因之一；而OE0528中sll0528的过表达可能保护或修复了光合系统损伤，使得OE0528在180mM氯化铵中相对于野生型较好地生长。结果提示Sll0528在集胞藻适应高浓度铵盐胁迫机制中起重要作用。（3）对突变体OE0528和野生型进行渗透压胁迫实验，在中强光条件0.5M山梨醇胁迫中，突变体OE0528生长速率高于野生型，叶绿素和藻胆蛋白含量也多于野生型，猜测sll0528可

7、能通过调控光合系统色素相关基因的表达使集胞藻适应山梨醇胁迫。突变体OE0528和野生型在氯化钠和高光胁迫下生长趋势相同，sll0528的过表达并没有使I集胞藻在这些胁迫中表现出胁迫适应优势。（4）在2.5mM葡萄糖混养条件下，slr0643敲除突变体Δslr0643生长速率和葡萄糖利用速率低于野生型，说明slr0643对集胞藻适应葡萄糖混养起重要作用。比较分析分别自养和葡萄糖混养处理的突变体Δslr0643与野生型转录组测序（RNA-Seq）数据，发现野生型通过减弱光合作用，提高氮代谢途径以及提高铁离子摄入来适应混养；而突变

8、体在适应混养过程中，渗透压调控相关基因上调，铁离子摄入下调，光合作用减弱更为显著，表明slr0643缺失导致突变体Δslr0643葡萄糖利用率下降，铁离子摄入下调和光合作用减弱；另外，混养胁迫下突变体与野生型相比，高渗透压调控相关基因上调，铁离子平衡紊乱，碳代谢途径下调，这些可能是混养下突