骨髓基质细胞联合施万细胞移植治疗帕金森病大鼠的实验研究

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1、中文摘要中文摘要骨髓基质细胞联合施万细胞移植治疗帕金森病的实验研究研究生：闵晓云导师：曾水林东南大学目的探讨骨髓基质细胞(BMSCs)联合施万细胞(SCs)脑内移植对BMSCs增殖、分化及对帕金森病(PD)大鼠的治疗作用。方法l、BMSCs培养：无菌条件下取体重1809l拘lSD大鼠胫骨和股骨，冲洗髓腔，将细胞悬液接种到含有15％胎牛血清(FBS)的DMEM／F12培养液中培养，7d后进行传代扩增，以获得充足的BMSCs，并用Brdu、流式细胞仪(FCM)检测。2、SCs培养：取新生8d的SD大鼠双侧坐骨神经，剥离神经外膜后剪成碎片，接种到含有15％胎牛血清的

2、DMEM／F12培养液中培养，按1：3进行传代。3、将培养传至第2代的SCs与第3代BMSCs共培养。用sl∞免疫荧光法，ncstin／Brdu、TH／Brdu免疫荧光法分别鉴定SCs和BMSCs的增殖与分化。4、立体定位下，于左侧黑质致密部(SNc)和腹侧被盖(VTA)注射6--OHDA制备PD大鼠模型。将成功PD大鼠模型随机分成3组，即对照组(注入生理盐水)：BMSCs移植组：BMSCs+SCs移植组。5、将上述培养传代至第3代的BMSCs和BMSCs+SCs，浓度为1．0X100细胞／m，分别移植到PD大鼠损伤侧纹状体内，于移植后7d、14d、30d检S

3、dPD大鼠旋转行为变化后，深麻下处死，灌流固定取脑做冰冻切片，行Brdu、TH免疫荧光染色。结果：细胞培养1、BMSCs原代培养24h后，可见瓶底有一些梭形或三角形的成纤维样细胞生长，它们多聚集成集落。此后3d细胞形态多趋向于成纤维样细胞形态，胞质丰富，核椭圆形，核仁清晰，呈平行排列生长或漩涡状生长，第3代BMSCs表面抗原经FCM检测，结果用CellQuest软件分析显示，所培养的细胞CD29和CD90为阳性，CD45为阴性，Brdu免疫荧光标记阳性。2、SCs培养24h后，可见少数贴壁细胞，3d后，大量细胞从组织块边缘迁出，胞体较小，呈长梭形，多为双极或多

4、极，偶见扁平椭圆形细胞，免疫荧光呈sl∞阳性反应。3、BMSCs+SCs共培养8h后细胞完全贴壁，细胞的立体感及折光性一般，突起较短。3d时，可见细胞数量较前明显增多，部分细胞胞体收缩，突起细长，呈双极、三极或多极；7d时细胞数量无明显增加，胞体立体感增强，一些突起末端出现分支，与相邻细胞的突起连接成网状。免疫荧光双标鉴定结果显示。3d时，可见ncstin／Brdu双标细胞，细胞核为Brdu红色标记，细胞浆及突起为nestm绿色标记，未见TH／Brdu双标细胞，7d时，nestin／Brdu双标细胞数目减少，可见TH／Brdu双标细胞，细胞核为Brdu红色标记

5、，细胞浆及突起为TH绿色标记，Brdu／ncstin(3d)、TH／Brdu(7d)阳性细胞率分别为(28．1±2．3)％，(19．2±1．6)％，而BMSC弹独培养组始终只见Brdu单标细胞，未见阳性双标细胞。在体移植1、细胞移植后第7d，各组大鼠的旋转行为无明显变化；第30d时，与对照组比较，BMSCs+SCs共移植组和单纯移植BMSCs组旋转行为有较为l中文摘要明显的改善(P<0．05)，其中BMSCs+SCs共移植组较单纯移植BMSCs组更为突出(P<0．05)。2、Brdu免疫荧光染色显示，移植区Brdu阳性细胞为TRITC红色荧光标记，大多数细胞较

6、小，无突起，呈圆形或椭圆形，少数呈多边形或不规则形态。3、TH免疫荧光显示，从第7d起，在移植区可见胞浆呈FITC绿色荧光标记的TH阳性神经元(12-23个，视野)，呈圆形或椭圆形，无明显突起，分布在针道与纹状体实质的交界处；在第30d，在针道的两侧TH阳性神经元增多(22-30个／视野)，有的可见少许突起。BMSCs移植组移植区也可见FITC绿色荧光标记的TH阳性神经元。经过图像处理和数据统计，BMSCs+SCs移植组TH神经元阳性率高于BMSCs单独移植组(尸

7、增殖和自我更新能力的BMSCs。2、从新生8d的SD大鼠双侧坐骨神经分离得到的细胞，体外培养后可被特异性抗体s-∞标记，观察到细胞形态特征与文献报道一致，证实是SCs。3、在体内、外条件下，SCs都能诱导BMSCs分化为TH阳性神经元。4、BMSCs单独移植或BMSCs+SCs联合移植入PD大鼠的纹状体内，对于PD大鼠的旋转行为均有改善，但联合移植优于单独移植。5、BMSCs、SCs可供选择用于中枢神经系统(CNS)损伤修复和再生的理想替代种子细胞，二者联合移植效果更好。关键词骨髓基质细胞；施万细胞；细胞培养；脑移植；免疫荧光；帕金森病；大鼠Ⅱ英文摘要ABST

8、RACTExperimentalStu