NGF刺激PC12细胞神经分化过程中转录因子E2F1参与PTPRO表达调控的研究

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1、摘要PTPRO是受体型酪氨酸磷酸酯酶家族的一员，其功能主要涉及神经组织中轴突的生长和导向，以及肿瘤抑制。用嗍表达具有组织特异性，在哺乳动物中群赃要表达于不同发育时期的肾脏组织和神经组织，而在很多肿瘤细胞中则通过DNA甲基化沉默。有文献报道，FFPRO在机体发育和脑的成熟中发挥重要作用，例如在肾脏中，用蹶达于发育早期的肾小球细胞顶部和发育成熟的肾小球足细胞顶部；在脑中，用嬲因最高表达出现于妊娠中后期，这一时期也是脑部轴突发生的主要时期。已有研究证明，受体型酪氨酸磷酸酯酶家族(RPTPs)成员在调节果

2、蝇神经系统发育过程中起主要作用。在脊椎动物中，许多受体型酪氨酸磷酸酯酶家族(RPTPs)成员例如：typeIIaRPTPs，typeIIIRPTP已经在轴突生长过程中发挥重要作用，但是PTPRO参与轴突生长的具体机制以及表达调控机制却报道很少。本论文旨在研究尸7腿因在NGF诱导PCI2轴突分化过程中表达升高的转录调控机制。通过反转录PCR(RT-PCR)、real-timeRCR和Westernblotinging检测我们发现，NGF诱导PCI2轴突分化后，尸7髓因表达发生了明显的上调。细胞转染和

3、荧光素酶报告基因分析结果显示，外源过表达转录因子E2F1H～匕显著提高尸7嗍动子荧光素酶报告基因的活性。real—timeRCR和westernbloting结果表明，转录因子E2F1提高了细胞内源刀礁因的mRNA和蛋白表达水平。点突变实验确定了刀黼动子上E2F1的结合位点。而ChIP实验表明E2F1能够结合在户7嗍启动子上。通过以上实验，我们初步地研究了PCI2细胞在NGF束IJ激后尸7臁达上调的调控机制。为下一步更详细的研究PTPRO在神经分化过程中的具体分子机制以及用燃因调控的具体机制定了基

4、础。关键词：PTPRO；E2F1；转录调控；轴突生长AbstractPTPROisamemberofthereceptor-typeproteintyrosinephosphatases(RPTPs)family,whichisinvolvedinpodocytefunction，axonpathfmdingandtumorsuppression．TheexpressionofPTPROvariesunderdifferentconditions．Forexample，inkidney,PTPRO

5、isexpressedontheapicalsurfaceofthepodocyteearlyindevelopmentandispresentontheapicalsurfaceofpodocytefootprocessesinthemamrephenotype；inbrain，maximalexpressionofPTPROiscoincidentwithmidtolategestationandaxonogenesis．ItisreportedthatReceptor-typeprotein

6、tyrosinephosphatases(RPTPs)arerequiredforappropriategrowthofaxonsduringnervoussystemdevelopmentinDrosophila．Inthevertebrate，typeIIaRPTPs[proteintyrosinephosphatase(PTP)andLAR(1eukocytecommon—antigenrelated)]andthetypeIIIRPTPhavebeenimplicatedintheregu

7、lationofaxongrowth。“1，However,peopleknowlittleabouttheregulationmechanismsforPTPROexpressionanditsfunctioninneuronaldifferentiation．ToclarifytheregulationofPTPROgenetranscriptionduringPC12neuronaldifferentiationafterstimulatedbyNGF,PCR(Real一timePCR)an

8、dWesternblotingwasusedtoexaminetheup-regulationofPTPROgeneinthedifferentiationofPC12cellline．Byapplyingaseriesoftransienttransfectionandrelativeluciferaseactivityassays，wefoundthattranscriptionfactorE2F1promotedtheactivitiesofthePTPROpromotere