miRNA-194-5p通过Stra8基因调控精子发生的初步研究

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1、分类号学号Ｍ１５０８２０ＵＤＣ密级爆叫大聲ｆａＹＡＮＧＺＨＯＵＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ｜硕士学位办文（学术型）－４－通过ＳｍｉＲＮＡ１９５ｐｔｒａ８基因调控精子发生的初步研究夏静指导教师姓名：郑英教授王建军教授，扬州大学，江苏扬州，２２５００９申请学位级别：碩士学科专业名称：临床医学（生殖）０１８年５月２０曰论文提交日期：２０１８年４月１３日论文答辩日期：２学位授予单位：扬州大学学位授予日期：２０１８年６月３０曰答辩委员会主

2、席：成勇教授２０１８年０５月－－１夏静ｍｉＲＮＡ１９４５通过Ｓｔｒａ８调控精子发生的初步研究ｐ＿本论文由以下基金资助：国家自然科学基金（Ｎ０．３１３７１１７４）江苏省自然科学基金（ＢＫ２０１３１２３０）２扬州大学硕士学位论文中文摘要目的：－－５本研宄旨在探索ｍｉＲＮＡ１９４ｐ能否通过Ｓｔｒａ８来调控精子发生。通过对出生后第１１天的Ｓｔｒａ８基因敲除（Ｓｔｒａ８勹及野生型雄性小鼠睾丸组织进行ＲＮＡ测序分析，筛选Ｓｔｒａ８缺失时差异表达的ｍａ８一

3、ｉＲＮＡｓ。验证其中差异表达的ｍｉＲＮＡｓ与Ｓｔｒ之间的关系，并进－－步探索ｍｉＲＮＡ１９４５ｐ是如何通过Ｓｔｒａ８来影响精原细胞增殖分化过程的。方法：＿Ａ１、饲养并收集不同周龄的野生型和Ｓｔｒａ８小鼠，用ＨＥ染色法分析其睾丸组织结构。选＿７？取出生后Ａ－１１天的野生型及Ｓｔｒａ８小鼠睾丸进行ＲＮｓｅｑ检测，筛选出差异表达的ｍｉＲＮＡｓ。应用实时定量ＰＣＲ法验证ｍｉＲＮＡｓ在两种小鼠睾丸组织中的表达水平，并检测它们在小鼠不同组织中的表达情况。－－－－－－、－ｃ－ＭＳＣ

4、Ｖｍ－２构建ｐＧＬ３ＢａｓｉＳｔｒａ８３ＴＪＴＲ重组质粒及ｐＰＩＧｉＲ１９４５ｐ／ｍｉＲ２０５３ｐ／ｍｉＲ３５４４－３ｐ重组质粒。利用双荧光素酶报告基因实验探索它们之间有无转录调控关系。应用ｍ－－ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ数据库分析ｉＲ１９４５ｐ与Ｓｔｒａ８之间的结合位点，并突变其结合位点，再次应用双荧光素酶报告基因实验验证两者之间的关系。－－－３、在２９３Ｔ细胞中用ＰＥ－ｍｉＲＩ法包装ｐＭＳＣＶＰＩＧ１９４５ｐ慢病毒，用此病毒感染Ｐ１９细胞并经嘌呤霉素筛选－－，获得过表达ｍｉＲ

5、１９４５ｐ的Ｐ１９细胞株。并利用实时定量ＰＣＲ法进行验证。４、将不同状态下的Ｐ－１９细胞株用ＲＡ处理，利用ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ及细胞免疫荧光检测ｍｉＲ－ｔｒ１９４５ｐ是否能通过Ｓａ８来影响Ｐ１９细胞向生精细胞分化的进程。结果：？１、与野生型小鼠相比，出生后第７天的小鼠睾丸生精小管内的支持细胞和精原细ｖ？胞并未出现明显的形态学差异。出生后第１４天的Ｓｔｒａ８小鼠睾丸生精小管内精母细胞明些精原细胞核出现异常深染－Ａ显减少。出生后第２１、２、、，有８３５５６天的Ｓｔｒａ８

6、小鼠睾丸生精小管内大部份生精细胞消失，部分生精小管内呈现多个生精细胞具有浓缩细胞核的初级精母细胞。ｖ？２－、应用ＲＮＡｓｅ法比较了出生后１１天的野生型和Ｓｔｒａ８小鼠睾丸６ｑ，发现了个差异表－－－－－－－－－、ｍ－－达的ｍｉＲＮＡｓ：ｍｉＲ１９４５ｐｉＲ２０５３ｐ、ｍｉＲ３５４４３ｐ、ｍｉＲｌａ３ｐ、ｍｉＲ３３７３ｐ、ｍｉＲ一－－－ｍ－３０ｃｌ３ｐ。经ＱＲＴＰＣＲ检测证实前５个ｉＲＮＡｓ表达趋势与ＲＮＡｓｅｑ结果相致。多组一－－－－织表达分析发现：ｍｉＲ１９４５

7、ｐ在睾丸组织中相对表达量较高，ｍｉＲ２０５３ｐ相对表达量－般３５４４－３，而ｍｉＲ在睾丸中的相对表达量较其它组织高ｐ。ＲＮＡ－－１５夏静ｍｉ９４ｐ通过Ｓｔｒａ８调控精子发生的初步研究［＇－－１９４５８３－３、双荧光素酶报告实验表明ｍｉＲｐ能显著降低ＳｔｒａＵＴＲ的荧光素酶活性，ｍｉＲ＇－－－－８３ＵＴＲ荧光素酶活性－２０５３ｐ和ｍｉＲ３５４４３ｐ不能降低Ｓｔｒａ。同时ｒａｉＲ１９４５ｐ不能降低Ｓｔｒａ８３ＴＪＴＲ－ｍｕｔ的荧光素酶活性。－－－４ＭＳＣＶ－、利用ＰＥＩ

8、转染法制备了ＰＩＧｍｉＲ１９４５ｐ慢病毒，且成功感染Ｐ１９细胞株并经ｐ－－－ＰＣＲ结果提示，ｍ嘌呤霉素筛选。ＱＲＴ：与空载体对照组比较ｉＲ１９４５ｐ在感染慢病毒的Ｐ１９细胞内表达水平明显提高，具有显著性统计学意义（ＰＣ０．０５）。５ＭＳＣＶ－－－４－－ｔｒ、ＲＡ诱导ｐＰＩＧｍｉＲ１９５ｐ慢病毒感染的Ｐ１９细胞株后，发现Ｓａ８ｍＲＮＡ及一些参与干细胞分化相关基因０蛋白水平均明显下调，而ｃｔ４、Ｐｌｚｆ、Ｎａｎｏｓ３、Ｖａｓａ的表－４－达均发生改变，说明ｍｉＲ１