生物降解与植物细胞壁结构的AFM单分子识别研究

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1、中图分类号：Q615论文编号：102870617-B006学科分类号：43099博士学位论文生物降解与植物细胞壁结构的AFM单分子识别研究研究生姓名张亚男学科、专业材料物理与化学研究方向生物纳米材料的单分子识别研究指导教师张海黔教授南京航空航天大学研究生院材料科学与技术学院二О一七年三月NanjingUniversityofAeronauticsandAstronauticsTheGraduateSchoolCollegeofMaterialsScienceandTechnologyTheStudyofBio

2、degradationandPlantCellWallStructureUsingAFMSingleMolecularRecognitionTechniqueAThesisinMaterialsPhysicsandChemistrybyZhangYananAdvisedbyProf.ZhangHaiqianandProf.XuBingqianSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofDoctorofPhilosophyMarch,2

3、017承诺书本人声明所呈交的博学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南京航空航天大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。本人授权南京航空航天大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本承诺书）作者签名：日期：南京航空航天大学博士学位论文摘要在大规模生物质的生化转化过程中，主要挑战包括：纤维素酶

4、的昂贵价格以及植物细胞壁复杂结构中多糖成分的酶解效率。这些挑战使越来越多的人对酶解的主导模式研究产生了浓烈兴趣。在单分子层面上研究生物能源的转化机理尤其重要。修饰分子的原子力显微镜（AFM）探针与样品特定成分之间的相互作用会引起探针在轻敲扫描过程中的共振振幅减小，信号处理之后会产生相应的识别图像。结合AFM高分辨形貌图像和特异性识别图像对生物分子进行分析的技术被命名为PicoTREC技术。PicoTREC是一种很重要的新型生物化学探测技术，该技术可以将AFM探针上配体相互作用的特定分子从复杂的样品结构中区别出

5、来，同时可以对分子的特定动态过程进行实时观察。在本论文中，结合一系列随时间变化的AFM形貌、振幅和识别图像，在单分子层面上实时观察生物质样本的原位酶解过程。另外，利用该识别技术观察原生质体细胞膜表面的类细胞壁结构的再生过程，特异性识别不同成分多糖和糖蛋白的生成状况，为进一步了解植物细胞壁的成分和结构奠定了良好实验基础。本论文研究成果如下：1）研究了糖结合模块分子（CBM3a）在晶体纤维素表面的单分子动力学过程，并利用AFM单分子动态力学谱（SMDFS）测量了该分子与纤维素之间的相互作用力；证实了CBM3a与晶

6、体纤维素之间具有特异性相互作用，其解离力大小为44.96±18.80pN，以及绑定纤维素最经济-7的CBM3a浓度值5.1Χ10M。对CBM-纤维素相互作用的单分子识别研究有利于对生物质-酶单分子相互作用的深入探索。2）将CBM3a修饰于AFM探针，从而利用CBM3a与晶体纤维素之间存在的特异性相互作用获得晶体纤维素的有效识别信号。通过AFM扫描自然细胞壁以及转基因细胞壁样品，进行对比分析其结构成分的不同。并在植物细胞壁酶解实验中，分析一系列随时间变化的AFM图像，得到不同酶水解细胞壁过程的单分子细节。纤维素

7、内切酶（EG）会有效移除自然样品中的非晶体纤维素，使晶体纤维更完整地暴露出来，从而有利于晶体纤维素的进一步水解。纤维素外切酶（CBHI）水解自然细胞壁样品的过程与样品表面结构的接触面积有关。然而由于自然细胞壁复杂结构，所以很难从中提取纤维素水解信息的细节。3）实时观察并定量检测预处理提取的纤维素被不同成分酶溶液完全水解的过程，不同种类水解酶之间的协同作用会显著加速纤维素水解。在对提取纤维素水解过程中，含有纤维素外切酶（CBHI）和β-葡糖苷酶（β-G）的酶溶液，与全酶溶液（主要成分为纤维素内切酶和纤维素外切酶

8、）相似的水解能力。利用功能化的AFM形貌图像和识别图像对提取的单个纤维素进行了全面的实时水解动态分析。根据纤维素基底表面的裂隙，将单个晶体纤维素分成几段不同的区域。在水解过程中，同时观察到两种不同的水解模式：有序的纤维素解聚和拥堵酶分子引起I原子力学显微镜单分子识别技术于生物降解与植物细胞壁结构的研究的纤维素剥落。重点观察和分析纤维素微纤维的剥落过程，总结出造成该现象的主要影响因素。一个区域的纤维素