基于骨细胞研究PTH及其受体信号通路在氟骨症发病机制中的作用

《基于骨细胞研究PTH及其受体信号通路在氟骨症发病机制中的作用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、＾Ｈ基于骨细胞研究PTH及其受体信号通路在氟骨症发病机制中的作用RoleofPTHanditsreceptorsignalingpathwayinthemechanismofskeletalfluorosisbasedonosteocytes作者姓名：于秀华专业名称：病理学与病理生理学指导教师：徐辉教授学位类别：医学博士论文答辩日期：2018年11月27日授予学位日期：年月日答辩委员会组成：姓名职称工作单位主席王丽教授东北师范大学委员陆军教授东北师范大学魏景艳教授吉林大学药学院井玲教授吉林大学药学院孙非教授吉林大学药学院未经本论文作者的书面授权，依法收存和保管本论文书

2、面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论文的全部或部分内容进行任何形式的复制、修改、发行、出租、改编等有碍作者著作权的商业性使用（但纯学术性使用不在此限）。否则，应承担侵权的法律责任。吉林大学博士学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果．除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文的研宂做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：＂日期，年月曰中文

3、摘要基于骨细胞研究PTH及其受体信号通路在氟骨症发病机制中的作用研究背景：骨细胞是骨组织中含量最丰富的细胞，在骨转换过程中发挥了重要作用，这已经被越来越多的研究所证实。而骨转换加速是氟骨症发病的主要环节，在此过程中氟刺激破骨细胞和成骨细胞致其出现不同程度的活跃，但氟对骨细胞影响的研究罕见报道。甲状旁腺激素（PTH）是甲状旁腺分泌的维持体内钙稳态的激素，同时调控骨转换过程，并参与了氟骨症的发病，研究证明骨细胞是PTH作用的关键效应物。因此本实验拟从体内、体外两方面探究氟对骨细胞的调控，以及其中PTH所起的作用，这在以往研究中很少涉及。本实验研究成果将对氟骨症发病机制的阐明具有一

4、定意义。实验方案：1.体外实验：本课题以小鼠原代骨细胞作为研究对象。实验设对照组，1、4、16mgF-/L三个梯度氟组，PTH组以及三个梯度氟联合PTH组，共8组。原代骨细胞提取后在富含胶原的培养基中培养5天，进行E11/gp38及OCN免疫组化进一步鉴定骨细胞。之后给予浓度分别为0，1，4，16mgF-/L的氟化钠，以及氟联合浓度为10nmol/L的PTH（1-34）进行处理，相关实验检测在加条件培养48小时后进行。不同条件下的细胞活性采用MTT法检测；原代骨细胞与RAW264.7细胞共培养5天，之后在光镜下计数各条件组形成破骨细胞样细胞的数量，并进行比较分析；暴露于氟及P

5、TH不同条件下原代骨细胞内成骨、破骨相关因子如核因子κB受体活化因子配体/骨保护素、硬化蛋白及Wnt-β连环蛋白信号通路各因子在基因和蛋白水平表达的变化利用实时定量PCR和蛋白杂交技术分别检测。2.体内实验：实验设置对照组、低剂量氟组以及高剂量氟组3组，每组平均20只清洁级成年雄性Wistar大鼠。投氟处理5周后，在三组大鼠每组中选取一半给予PTH（1-34）试剂灌胃，实验最后分为：对照组，10mgF-/kg·day组，I20mgF-/kg·day组，PTH组，10mgF-/kg·day+PTH组，20mgF-/kg·day+PTH组，共6组。PTH联合氟继续处理3周后处死大

6、鼠（乙醚麻醉），收集股骨、胫骨等骨组织测定骨密度，经眼球取血进行生化分析，并应用实时定量PCR检测骨组织相关基因。实验过程中每周对大鼠进行称重并观察其牙齿变化。氟中毒大鼠骨组织的骨密度、成骨、破骨标志物水平及相关基因的变化是主要观察对象。动物实验部分主要确定氟骨症大鼠模型的成功复制，进一步验证体外实验的结果以及明确PTH对氟骨症骨转换加速过程的影响。实验结果：1.体外实验：成功从3月龄雄性ICR小鼠股骨分离原代骨细胞并培养，免疫组化确定骨细胞E11/gp38高表达及OCN低表达的特征。MTT结果显示低剂量氟轻度刺激骨细胞活性，而高剂量氟轻度抑制其活性。PTH也表现为轻度抑制作

7、用，但进一步调节了氟对骨细胞活性的影响。骨细胞对RAW264.7细胞诱导破骨细胞分化的作用明显，验证了在体外骨细胞分泌RANKL。投氟刺激骨细胞产生RANKL，并且PTH进一步加强了氟的促进作用。实时定量PCR结果表明，氟和/或PTH均明显抑制骨细胞中Sost表达，高剂量氟作用最明显。低、中剂量氟显著增加了RANKL基因表达和RANKL/OPG比例，PTH明显上调RANKL/OPG比例并大大增强了氟对RANKL/OPG的促进作用。进一步实验表明氟促进原代骨细胞PTH1R及Wnt/β-Catenin信号转