氟作用条件下pth、pth-rp、casr表达变化及在氟骨症发生机制中的作用

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1、—————————————————————氟作用条件下PTH、PTH-rp、CaSR表达变化及在氟骨症发生机制中的作用—————————————————————PTH,PTH-rp,CaSRexpressionanditsroleinthepathogenesisofskeletalfluorosis————————————作者姓名：王莹专业名称：病理学与病理生理学研究方向：氟骨症发生机制研究指导教师：井玲教授学位类别：医学博士培养单位：吉林大学药学院论文答辩日期：2015年6月1日授予学位日期：年月日论文评阅人：答辩委员会组成：姓名职称工作单位姓名职称工作单位徐长庆教授哈尔滨医科大学主

2、席孙非教授吉林大学药学院陈允震主任医师山东大学委员裴瑾教授吉林大学药学院刘忠英教授吉林大学药学院魏景艳教授吉林大学药学院曾宪录教授东北师范大学朱平教授军事医学科学院王丽教授东北师范大学陆军教授东北师范大学中文摘要氟作用条件下PTH、PTH-rp、CaSR表达变化及在氟骨症发生机制中的作用目的：根据临床流行病学资料和我们多年来的实验病理学观察，认为成骨活跃和骨转换加速是氟骨症进展期的重要特征和形成骨病变多样性的病理基础，膳食低钙是氟骨症的主要促发和加重因素，整体低钙—甲旁腺素（PTH）分泌增多—靶细2+胞内Ca升高这种“钙矛盾”（Calciumparadox）参与了氟骨症的发病机制。但其确

3、切作用机理尚不明确。甲旁腺素相关肽（PTH-rp）具有明显的PTH活性，在人体骨微环境中扮演重要角色，对先天骨发育和后天骨的代谢均有重要作用，在生理和病理状态下调控靶细胞的增殖和分化。成骨细胞自身可以合成PTH-rp及其受体，以自分泌和旁分泌方式在骨形成过程中发挥重要作用。鉴于迄今氟骨症发病机制研究中尚未深入涉及PTH-rp，因而是本项目研究的重点内容之一。钙敏感受体（calciumsensingreceptor，CaSR)属于G蛋白偶联受体家族，广泛分布于甲状旁腺、甲状腺C细胞、肾脏、骨和肠等组织，在维持机体钙稳态，调节细胞生长、分化和凋亡方面起重要作用。有实验表明，CaSR对成骨细胞

4、分化和甲状旁腺功能均有重要作用。在研究氟骨症骨转换增强发生机制的过程中，CaSR的作用值得关注，但有关这一方面迄今尚未见报道。因此也作为本研究重点探讨内容。本课题将通过氟中毒动物模型和体外成骨细胞染氟，观察氟对动物血清和体外细胞培养上清钙离子浓度、骨组织和成骨细胞中PTH、PTH-rp的mRNA和蛋白表达，探讨PTH、PTH-rp在促进成骨细胞功能活跃和骨转换增强中的分子机制；同时，观察CaSR在染氟成骨细胞中的变化并探讨其可能作用。方法：分为体内和体外两部分进行。体内部分：将40只SD大鼠按体重分为四组，每组10只。适应性喂养一周后，利用富钙平I衡饲料和低钙偏食饲料饲养大鼠，并经饮水投

5、氟（分析纯NaF）复制氟中毒模型，每日更换食水，实验期限为2个月。具体分组和实验处理因素如下表：表1实验动物分组及处理因素动物数组别处理因素（只）#￥富钙平衡对照组（ctrl组）10常规营养饲料，自来水-富钙平衡加氟组（G1组）10常规营养饲料，自来水加氟100mg/LF*偏食低钙对照组（G2组）10低钙偏食饲料，自来水-偏食低钙加氟组（G3组）10低钙偏食饲料，自来水加氟100mg/LF实验期末检测氟中毒大鼠血清中钙离子浓度，骨组织中PTH、PTH-rp、CaSR、OPG、RANKL等的mRNA和蛋白表达；体外部分：应用成骨细胞株（MC3T3-E1）。实验处理因素如下表：表2细胞染氟及

6、分组组别实验处理因素对照组培养基-染氟1组（F2组）培养基加入2mg/LF-染氟2组（F5组）培养基加入加入5mg/LF-染氟3组（F10组）培养基加入10mg/LF应用CCK-8方法检测细胞增殖活性，生化自动分析仪检测培养液中钙离子浓度，Realtime-PCR和WesternBlot法检测PTH、PTH-rp、CaSRmRNA和蛋白的表达量。结果：1.体内实验：1）与富钙平衡对照组（ctrl组）比较，富钙平衡加氟组（G1组）血清钙离子浓度降低；PTHmRNA表达明显降低，蛋白表达明显升高(P＜0.01）；PTH-rpmRNA及蛋白量均明显降低(P＜0.05）；CaSRmRNA及蛋白表

7、达明显升高(P＜0.05）；CTmRNA表达降低，蛋白表达升高(P＜0.01）；骨组织中OPG、RANKLmRNA及蛋白量、RANKL/OPGmRNA及蛋白比值均有不同程度增加，其中IIRANKLmRNA和RANKL/OPGmRNA比值明显升高（P<0.01）；2）与偏食低钙对照组（G2组）比较，偏食低钙加氟组（G3组）大鼠血清游离钙离子浓度明显降低；PTH和PTH-rpmRNA及蛋白表达均明显升高(P＜0.01，P＜0.05）；C