《科内讲课要点》PPT课件

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1、2021/9/291基因扩增及其相关检测技术应用2021/9/292一、基因体外扩增是指体外无细胞的分子克隆或酶促扩增。以DNA或RNA分子为模板，在引物诱导下，根据碱基配对原则，利用反应体系中的dNTPs为原料，酶促合成新的DNA序列，使基因拷贝数得以增多的技术。2021/9/293基因体外扩增方法聚合酶链式反应（PCR）以PCR技术为基础的相关技术（逆转录PCR、巢式PCR、多重PCR、定量PCR、原位PCR、单细胞PCR等……）实时PCRPCR产物分析……2021/9/294（一）PCR技术2021/9/295PCR（polymerasechainre

2、action）聚合酶链式反应：指利用模板DNA、RNA为指导，在引物引导下，DNA聚合酶促化合成、扩增DNA序列的技术。又称体外分子克隆。2021/9/296PCR反应原理PCR技术的原理类似于DNA天然复制过程，其特异性依赖于靶细胞序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR有变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成。2021/9/297PCR反应原理(1)(2)(3)(1)模板DNA变性模板与引物的退火（复性）引物的延伸模板DNA变性TaqDNAdNTPs2021/9/298PCR反应体系的组成:引物酶dNTP模板Mg2+探针2021/9/299引物：引物是PCR特异

3、性反应的关键，PCR产物的特异性取决引物与模板DNA互补的程度。PCR引物的要求：片段特异、长度、C＋G%、浓度等。2021/9/2910酶及其浓度：两种TaqDNA聚合酶（ThermusAquaticus）从栖热水生杆菌中提纯的天然酶大肠菌合成的基因工程酶。浓度：浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少2021/9/2911dNTPs：(A、C、G、T)dNTPs四种脱氧核苷三磷酸是DNA合成的基本原料dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系。在PCR反应中，dNTP应为50～200mol/L，浓度过低又会降低PCR产物的产量太少，出现假

4、阴性。2021/9/2912模板核酸：模板核酸提取质量是PCR成败与否的关键环节之一提取效率扩增效率传统的DNA纯化方法：热裂解法蛋白酶消化法2021/9/2913RNA模板：RNA模板提取一般采用：异硫氰酸胍-氯仿-酚抽提法蛋白酶K法-氯仿-酚抽提法要防止RNase降解RNA：干烤或DEPC（焦碳酸二乙酯）处理2021/9/2914Mg2+浓度：Mg2+是TaqDNA聚合酶活性所必需的，其浓度高低直接影响着酶的活性与忠实性Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜，Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异

5、扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少2021/9/2915PCR反应条件的选择缓冲液:pH8.3～8.8，Tris-HCl缓冲液10～50mMol/LPCR反应温度与时间循环次数2021/9/2916三温度法：90～95℃（94℃10S）变性30s40～60℃（55℃30S）退火，30s~1min70～75℃（72℃40S）延伸，1~2min二温度点法94℃变性（94℃5S）60℃左右退火与延伸（60℃40S）温度与时间2021/9/2917循环次数：循环次数决定PCR扩增量。在其他参数都优化的条件下，最适循环次数取决于靶序列的初始浓

6、度。初始浓度较低时，要增加循环次数。酶的活性不好或量不足时，也要增加循环次数，已达到有效扩增量。一般的循环次数选在30～40次之间。循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。2021/9/2918PCR产物检测终点检测法（定性）凝胶电泳分析法点杂交法微孔板夹心杂交法PCR-ELISA实时检测法（定量）2021/9/2919PCR扩增产物的电泳分析PCR电泳法是科研不可缺少的手段琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳2021/9/2920琼脂糖凝胶电泳1.凝胶与电泳缓冲液配制2.核酸电泳的指示剂与染色剂溴酚兰溴化乙锭染色法3.电泳：4.结果观察：紫外仪上观察电泳带及其

7、位置，并与核酸分子量标准比较被扩增产物的大小2021/9/2921琼脂糖凝胶电泳条带2021/9/2922聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶的制备电泳：电压为1-8V/cm观察：浸入含0.5ug/ml的溴化乙锭溶液中，15～30min后取出水洗紫外仪下观察结果2021/9/2923PCR电泳法检测的局限性产物非杂交检测，特异性差开放操作，扩增产物（百万倍）气溶胶的污染问题突出非定量检测，无法观察疗效肉眼判读，人为误差（扫描）溴化乙锭的致癌作用（二）实时荧光定量PCR2021/9/2925实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR技术:在PCR反应体系中加入荧光探

8、针基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后