微生物分子生态学实验讲义

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1、2004年全国微生物分子生态学研究技术培训班实验讲义上海交通大学微生物分子生态学和生态基因组学实验室二零零四年七月二十五日2004年全国微生物分子生态学研究技术培训班实验讲义主办单位：中国生态学会微生物生态专业委员会中国微生物学会环境微生物专业委员会协办单位：上海市微生物学会承办单位：上海交通大学生命科学技术学院华东师范大学环境科学与技术系二零零四年七月二十五日目录实验一环境样品总DNA提取1实验二ERIC-PCR指纹图谱技术在分子生态学中的应用11实验三环境16SrDNA文库的构建与组成分析技术17实验四变性梯度凝胶电泳（DGGE）和温度梯度凝胶电泳（TGGE）33实验五微生物群落结

2、构分析中的分子杂交技术54实验六实时定量PCR技术63实验七微生物分子生态学常用软件使用方法70实验一环境样品总DNA的提取微生物的多样性对其所在的生态系统所发生的生化反应具有重要的影响(11)，微生物的组成与活性能够反应出生态系统的功能状况。传统的培养方法虽然可以检测环境中的活细胞，并且对微生物生态学的发展起了很重要的作用，但是很多研究表明环境样品中的大部分的细菌是不能被分离和培养的(2)，Amann等人报道在自然环境样品中可培养的微生物在环境中的总的微生物中所占的比例范围从0.001%（海水）到0.3%（土壤）(1)。所以，传统的培养方法不能全面地反映微生物区系组成状况。直接对环境

3、样品中分离的微生物总DNA进行分析的方法在一定程度上克服了传统方法的弊端，避开了纯培养的步骤，减少了处理时间(23)，而且能对很多难培养的微生物进行分析。环境样品总DNA的提取是微生物分子生态学研究中的最重要的实验技术之一，高质量DNA的提取是进行后续实验的基础。由于环境样品种类繁多、组成复杂、物理化学性质多变，使得传统的对纯培养微生物提取DNA的方法很难直接应用到环境样品的研究中，因为纯培养的细胞（inoculatedbacteria）通常比环境中的原有的细胞（autochthonousbacteria）更容易裂解(10,21,23)。随着微生物分子生态学的发展，各种提取环境样品DN

4、A的方法陆续建立起来，但是对多种环境样品而言，没有一种方法能适用于所有的环境样品，每一种样品根据其特有的理化和生物学特性，都需要优化出一种特有的提取DNA的方法(26)。本实验室经过多年的摸索，已经建立了成熟的在活性污泥、人畜粪便、土壤、石油、生物肥料等复杂的环境样品中提取微生物总DNA的方法。其中在粪便样品的DNA提取方法可以参考本实验室魏桂芳的文章(25)，本培训班所讲述的提取DNA的方法是在提取焦化工业废水处理装置的活性污泥中的总DNA中建立起来的，本实验室的其他实验证明此方法也可有效用于提取部分的生物膜、土壤、石油、生物肥料等环境样品的总DNA。一、实验原理：环境样品DNA的提

5、取流程可参考下图(6)图1环境样品DNA提取流程(6)样品的最初处理可以分为直接裂解和先分离细胞再进行裂解，分离细胞主要利用离心等方法来得到完整的细胞，然后提取所得细胞的DNA,直接裂解的方法是不分离细胞而直接对环境样品进行裂解，目前应用比较多的方法是直接裂解法，这种方法比先回收细胞的方法具有更高的回收效率，由于有更多的微生物被裂解，所以这种方法回收到的DNA看起来更能代表样品中的微生物(6)。直接裂解的方法的弊端在于用此种方法提取的土壤，污泥等样品中通常会含有腐殖酸（humicacid）和棕黄酸（fulvicacid）等杂质，由于这些杂质会影响到后续的分析，尤其是PCR扩增(20,2

6、2,24)，所以这种方法得到的DNA通常需要进一步纯化。1.细胞裂解：细胞裂解是提取DNA过程中最重要的步骤之一，是指破坏细胞壁和细胞膜的过程，常用的裂解方法包括化学裂解、酶裂解和机械裂解。化学裂解和酶裂解通常是比较温和的方法，通常会很少使DNA断裂。这两种方法（包括SDS和溶菌酶处理等）是传统的提取纯培养微生物DNA中常用的方法。对于环境样品，这两种方法通常会只识别特定类型的细胞而且不能彻底穿透土壤或者沉积物等样品，机械裂解可以更均一的裂解细胞并且可以更好的穿透土壤和沉积物等样品，More等人在研究土壤样品时发现，同化学裂解相比，机械处理具有更高的裂解效率和更低的选择性(14)。机械

7、处理可以更剧烈和全面的裂解细胞，但也会造成DNA的断裂(17)。热休克（Thermalshock）是一种常用的机械裂解方式比，通常由冷冻和解冻两部分组成（freezingandthawing）,冷冻通常在液氮或冰上进行，解冻可以在50、65或100℃水浴中进行。(3-5,7,14,18)热休克比化学裂解温和，但是很有效，Lee等人用热休克和溶菌酶与SDS的方法获得了90%的细胞裂解率(12)。超声波处理（Ultrasonication）可以有效