人胆酸转运蛋白基因的克隆、亚细胞定位及其在肾组织中的表达

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1、维普资讯http://www.cqvip.com中国病理生理杂志ChineseJournalofPathophysiology2008，24(2)：335—339·335·[文章编号]1000—4718(2008)02—0335—05人胆酸转运蛋白基因的克隆、亚细胞定位及其在肾组织中的表达白雪源，马玉香，罗成华，师锁柱，侯剀，冯哲，傅博，陈香美(解放军总医院’全军肾脏病研究所暨肾病重点实验室，普外科，北京100853；青海大学附属医院肾内科，青海西宁810001)[摘要]目的：克隆人肾与小肠ASBT(顶端Na／胆汁酸协同转运蛋白)基因并比较2者的序列差别，明确ASBT蛋

2、白在肾小管上皮的亚细胞定位及在人肾组织中的表达情况。方法：从人肾和小肠组织中提取总RNA，然后用带有8肽FLAG标签的PCR引物通过RT—PCR技术扩增ASBT全长cDNA基因并测序，并将其插入真核表达载体中构建ASBT蛋白真核表达载体，然后将其转染到肾小管上皮细胞LLC—PKI中表达并用免疫荧光一激光共聚焦显微镜观察该蛋白的亚细胞定位情况。用免疫组化技术观察ASBT在人肾组织中的表达分布。结果：序列分析结果表明肾小管ASBT基因的序列与小肠ASBT序列完全～致。Westernblotting表明ASBT基因在LLC—PKI细胞中得到了正确的表达。共聚焦显微镜分析显示正

3、常ASBT蛋白主要定位于肾小管上皮细胞膜上，与生物信息学的预测结果一致。免疫组化染色表明ASBT蛋白主要表达于人近端肾小管上皮的刷状缘侧，在间质及远端小管没有表达。结论：人肾小管ASBT基因序列与小肠ASBT相同，ASBT蛋白主要表达于近端肾小管上皮细胞管腔侧细胞膜。[关键词]胆汁酸类；肾小管；亚细胞定位；载体蛋白质类[中图分类号]0493．8，Q735[文献标识码]AGenecloning，subcellularlocalizationandexpressioninkidneytissueofhumanASBTproteinBAIXue—yuan，MAYu—xiang

4、。，LUOCheng—hua，SHISuo—zhu，HOUKai，FENGZhe．FUBo．CHENXiang—mel(ChinesePLAInstituteofNephrology，DepartmentofGeneralSurgery，ChinesePLAGeneralHospital&MilitaryPostgrad-uateMedicalCollege，Beijing100853，China；DepartmentofNephrology，TheAffiliatedHospitalofQinghaiUniversity，Xining810001，China．E—ma

5、il：xmchen@public．bto．net．ca)[ABSTRACT]AIM：TocomparethecDNAsequencesofASBT(apicalNa／bileacidcotransporter)geneclonedfromhumankidneyandintestinetissues，andtodeterminesubcellularlocalizationofASBTinrenaltubularepithelialcellsandexpressionsiteofASBTinhumankidneytissue．METHODS：ThetotalRNAwase

6、xtractedfromhumankidneyandin—testinetissues．Thefull—lengthcDNAgeneofASBTwasamplifiedbyRT—PCRtechniqueusingprimerswith8一peptideFLAGtag，sequencedandinsertedintoeukaryoticexpressionvectortoconstructASBTproteinexpressionvector，whichwasthentransfectedintoswinerenaltubularepithelialcelllineLLC

7、—PKI．ThesubcellularlocalizationofASBTproteinwasdeterminedbyimmunofluorescencestainingandlaserconfocalmicroscope．Immunohistochemicalanalysiswasusedtoob—serveexpressionpositionofASBTinkidneytissue．RESULTS：TheresultsrevealedthatthesequenceofkidneyASBTcD—NAgenewasidenticaltot