Ag85ADNA疫苗对荷瘤鼠Th1细胞免疫功能的影响

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1、C．耍照豳A邸5ADNA疫苗对荷瘤鼠Thl细胞免疫功能的影响刖暑A邸5复合物是一分子量为30～32kDa的蛋白质家族，主要由A邸5A，A985B，A985C三种蛋白质组成，是结核分枝杆菌分泌蛋白和BCG培养滤液的主要成分。它们具有海藻糖双霉菌酸酯(即索状因子)生物发生所需的分枝酰转移酶活性，是分枝杆菌细胞壁的主要成分。其中A985A可能是细菌生长和维持毒力的最重要成分。以A酪5A为基础制备的DNA疫苗在动物实验中上调了机体的细胞免疫应答：诱导强烈的T细胞增殖，主要表现为以IL一2和IFN一7等细胞因子分泌上调为特征的Thl型细胞免疫应答。

2、肿瘤是一种全球致死性疾病，目前尚无根治方法。一直认为在抗肿瘤免疫中CD8+T细胞起主要作用。近年来，Thl细胞在抗肿瘤中的作用越来越受到关注。人们逐渐认识到在激活抗原特异性CTL的同时还要活化辅助性T细胞才能产生有效的抗肿瘤免疫。为了探讨A醴5A能否在肿瘤患者这样一个低细胞免疫应答的机体内激发Thl型细胞免疫应答，本实验通过给Meth—A纤维肉瘤荷瘤小鼠肌肉注射A985ADNA疫苗，观察该疫苗对荷瘤鼠Thl型细胞免疫应答的影响，作为我们研究A985A对肿瘤免疫治疗作用的第一步。实验材料与方法用碱裂解法从减毒伤寒杆菌中提取A985A—VlJ

3、ns．tpA质粒和VlJns．tpA质粒，经琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶回收试剂盒(QIAGelExtrac-quicktionKit)回收所需质粒，然后转化JMl09大肠杆菌。从转化成功的大肠杆菌提取质粒后，用BglII限制性内切酶消化质粒，经琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。碱裂解法大量提取质粒后用聚LZ．醇法纯化，调整浓度为Ig／L，一20％保存。BALB／c雌性小鼠(18—209)，6—8周龄，随机分成质粒组(A985A—VlJns．tPA组)，空质粒组(V1Jns．tPA组)和生理盐水组三组，将2×105个Meth—A细胞接种于小鼠右侧背部皮

4、下，l天后于小鼠大腿肌肉注射100一A985A—VlJns．teA(19／L)，VlJns．t_PA(19／L)或生理盐水。每10天一次，共3次，于末次免疫后第8天，检测NK细胞杀伤活性，并无菌取脾，细胞培养。培养48小时后收集上清。一70。C保存。按照ELISA试剂盒说明书检测脾细胞培养上清中IFN—y含量。实验数据以均数4-标准差(叉±s)表示，用t检验进行显著性分析。实验结果末次免疫后第8天，实验组平均NK细胞杀伤率以及脾细胞培养上清中IFN一1水平均高于空质粒组和生理盐水组(P<0．05)，而空质粒组和生理盐水组相比，则未见有意义

5、的变化(P>0．05)。这提示肌肉注射A985ADNA疫苗可以提高Meth—A肿瘤小鼠的NK细胞杀伤活性以及脾细胞培养上清中[FN一1水平。讨论本实验结果表明A985ADNA疫苗可以提高Meth—A纤维肉瘤荷瘤鼠NK细胞的杀伤活性以及脾细胞培养上清中IFN一1的水平。这是关于A985A对Meth—A纤维肉瘤荷瘤鼠免疫指标的首次检测，仅仅是我们研究A邸5A对肿瘤免疫治疗作用的第一步。DNA疫苗是将编码目的抗原的基因以重组表达载体的形式经各种转移途径转入机体细胞，借用宿主细胞的加工，表达抗原分子，进而激活机体的免疫应答。其优点为：可以模拟活病

6、原体自然感染过程，不断表达具有较强免疫原性的抗原蛋白；易于精选所需基因片段，有的放矢的激发机体的免疫应答；诱导机体产生持久而强烈的体液和细胞免疫应答。本实验通过给Meth—A纤维肉瘤小鼠肌肉注射A985ADNA疫苗，观察该疫苗对Meth—A纤维肉瘤小鼠Thl细胞免疫应答的影响。结果提示肌肉注射A985ADNA疫苗可以上调荷瘤鼠NK细胞杀伤活性以及脾细胞培养上清中IFN—r的水平。推测这种上调机制可能为：(1)A985ADNA疫·2·苗进入机体后可以激活抗原特异性的CTL和Thl型T细胞，二者均可释放IL一2，IFN一1等细胞因子，这些细胞

7、因子可以进一步活化NK细胞；(2)由于A985ADNA疫苗比BCG和结核杆菌具有更广泛的表位库，可以更广泛的激活CTL，释放更多的IL一2和IFN一'等细胞因子，从而激活NK细胞；(3)NK细胞，IFN一1和APC问的正反馈环路作用。本实验结果表明，肌肉注射A鹃5ADNA疫苗可以上调荷瘤鼠NK细胞杀伤活性以及脾细胞培养上清中IFN—y的水平，即激活了机体的Thl细胞免疫应答。因此，考虑A985A可能作为n细胞的激活剂与肿瘤抗原一同发挥抗肿瘤免疫的作用。为了进一步探讨A985A对肿瘤的作用，我们将构建A酗5A和肿瘤抗原的融合质粒，来观察它对

8、肿瘤的作用，以完善对A985A生物学功能的认识。结论1．肌肉注射A985ADNA疫苗可以提高Meth—A纤维肉瘤荷瘤小鼠NK细胞杀伤活性和脾细胞培养上清中IFN一1的水平。2．A985A可能作