茶树分子遗传图谱构建及多酚氧化酶基因的SNP研究

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1、湖南农业大学博士学位论文茶树分子遗传图谱构建及多酚氧化酶基因的SNP研究姓名：黄建安申请学位级别：博士专业：茶学指导教师：黄意欢;罗军武20041001茶树分子遗传图谱构建及多酚氧化酶基因的SNP研究摘要茶树『Camelliasinensis(L．)0．Kuntze]原产于中国，目前已成为一种世界性的重要经济作物，也是21世纪最流行的健康饮料植物。关于茶树分子标记技术及遗传多样性在DNA分子水平上的研究，于20世纪90年代中期开始在国内外均作了一些开创性的工作，但与其他重要经济作物相比，仍存在有较大的差距。相对应用较多的只有RAPD标记，其他如RFLP、S

2、SR和AFLP遗传标记的研究资料屈指可数；由于茶树是一种高度异质性的多年生异花授粉植物，也使茶树遗传图谱的构建十分困难；特异PCR标记技术如PCR-RFLP需建立在已知核苷酸序列信息的基础上，而有关茶树的核苷酸序列信息相对较少，故限制了其在茶树遗传研究中的应用。从常规的分子标记技术过渡到直接对D1qA碱基序列的多态性进行研究，是现代分子群体遗传学发展的必然趋势，但到目前为止，用于基因突变检测和SNP分析的新技术，大多局限于医学上的应用，而在农业上的应用研究还鲜见报道。本研究首先从建立适用于茶树基因组DNA多态性分析的AFLP、ISSR、PCR-SSCP标记

3、方法着手，并用这些标记技术研究优异茶树种质资源的遗传亲缘关系；同时借鉴多年生果树及林木分子图谱构建时采用的“双假测交理论”(doublepseudo．testcrossformat)，利用在国内十分难得的茶树杂交F1代群体(祁门4号×潮安大乌叶)构建茶树的分子标记连锁遗传图谱。本研究在第二部分对茶树多酚氧化酶(PPO)基因的SNP进行研究，以已克隆茶树PPO基因的部分序列为模板，采用PCR—SSCP分析与对部分个体进行DNA测序相结合的方法，对不同茶树品种(株系)的PPO基因作SNP搜寻，并对酶切位点变异作进一步的PCR-RFLP分析，以探讨SNP与茶树品

4、种适制性及遗传背景的关联性。本文主要研究结果如下：1、对植物DNA提取的4种方法(CTAB常规法、CTAB区室法、SDS常规法、SDS区室法)进行改良后，经对比研究发现：4种方法均能提取高质量的DNA，其OD260／OD280都在1．80～1．92之间、分子量均大于21Kb、都能完全被EcoRI酶切消化、也能获得清晰的PCR扩增图谱。并以鲜叶为对照，研究在一20℃、一70。C保存及硅胶脱水干燥法保存鲜叶样品对DNA提取质量的影响，结果表明：用鲜叶和该几种方法保存的样品提取基因组DNA的效果完全相同，硅胶脱水干燥法是一种较好的鲜叶保存方法，解决了茶树分子生物

5、学研究远距离采样时样品保存的难题。2、采用银染法代替同位素标记法，建立了分辨率高、重复性好的茶树AFLP一银染显色技术体系。根据所建立的AFLP一银染技术体系，对不同茶树品种的指纹图谱进行了初步研究，结果发现，同一引物对不同品种扩增及不同引物对同一品种扩增都呈现出十分丰富的多态性。因此，AFLP分析技术是一种揭示茶树遗传变异的十分高效可靠的方法，非常适合于构建不同茶树品种的指纹图谱，为茶树品种保护、种质鉴别、种子与苗木的纯度检测及真假辨别提供科学依据。3、研究分子标记在作图群体中的分离状况是构建遗传图谱的基础。本研究借鉴“双假测交理论”，以祁门4号×潮安大

6、乌叶的Fl代群体为材料，对AFLP、RAPD与ISSR标记在FI代群体的分离方式及分离比例进行研究，结果表明，3种标记在该Fi代群体中呈现孟德尔分离、偏盂德尔分离及异常分离3种分离方式。在D=O．Ol水平上，AFLP标记的3种分离方式出现的频率分别为93．37％、6．18％、0．52％，其中孟德尔分离位点占分离位点总数的73．40％；在孟德尔分离位点中发生1：1分离的位点为69．41％，发生3：1分离的位点为30．59％。ISSR标记的盂德尔分离与偏孟德尔分离方式出现的频率分别为78．57％和21．43％，无异常分离。RAPD标记的3种分离方式出现的频率分

7、别为82．93％、14．63％和2．“％。4、采用Mapmaker3．0软件对22对AFLP引物扩增所得的有效标记位点进行连锁分析，分别构建了祁门4号与潮安大乌叶的AFLP分子标记连锁图谱，其中母本图谱包括由208个标记组成17个连锁群，总图距为2457．7cM，平均图距为11．9cM。父本图谱包括由200个标记组成的16个连镆群，总图距为2545

8、3cM，平均图距为12．8cM。本研究结果证实，AFLP标记是目前为止可用于茶树遗传图谱构建的最高效的分子标记；所选用的Fl代群体是非常适合于构建遗传图谱的分离群体：“双假测交理论”对茶树分子遗传图谱的构建具有

9、十分重要的推动作用。5、通过对ISSR与RAPD标记位点进行连锁分