《基因探针》PPT课件

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1、基因探针CHENPUYAN基因探针基因探针又称核酸分子杂交技术，是在1968年由华盛顿卡内基学院（CavnegieInstituteofWashington）的RoyBritten及其同事发明的。基因探针是指能与特定的靶分子序列发生特异性相互作用的标记分子.也就是指一段能识别(与目的序列或靶序列互补)特异性碱基序列(基因)的标记同位素等标记物的单链DNA或RNA的分子。检测DNA的技术称为.Southernblot杂交.检测RNA的技术称为.Northernblot杂交.检测蛋白质的技术称为.Westernblot杂交.还有dotblot,原位杂交技术等.杂交类型固相杂交液相杂交核酸

2、分子杂交(固相杂交)Northern杂交Southern杂交芯片以上方法决定杂交模板核酸性质,DNASouthern杂交.RNANorthern杂交探针与核酸杂交的方法1）斑点杂交(dot-blot)2）菌落/噬菌斑：转印筛选法3）组织/细胞(DNA或RNA)：原位杂交(insituhybridizationISH).Southern-blot(DNA)、Northern-blot(RNA)DNA和RNA操作基本一样，只是电泳所用的胶有所不同(RNA易形成二级结构)探针基因的分离制备同位素或非同位素标记标记基因探针的纯化检测样品核酸制备杂交膜制备或转印预　杂　交杂　交洗　膜图3-3核

3、酸探针杂交试验全过程示意图（a）（b）（c）（d）（e）基因组DNADNA限制片段硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的基因DNA片段X光底片Southern凝胶转移杂交技术RNA印迹技术（Northernblotting）1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与萨瑟恩DNA印迹杂交技术十分类似,所以叫做诺赛恩RNA印迹技术（Northernblotting）。而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射性同位素125I标记的特定蛋白质之抗体进行反应,这种技术叫

4、做韦斯顿蛋白质杂交技术（Westernblotting）。斑点印迹杂交和狭线印迹杂交斑点印迹杂交（dotblotting）和狭线印迹杂交（slotblotting）是在Southern印迹杂交的基础上发展的量种类式的快速检测特定核酸（DNA和RNA）分子的核酸杂交技术。由于在实验的加样过程中使用了特殊设计的加样装置，使众多待测样品能够一次同步转移到杂交滤膜上，并有规律地排列成点阵或线阵。这两项技术更适应与核酸样品的定量检测。检测重组体克隆的菌落杂交技术菌落杂交原位杂交(insituhybridizationISH)原位核酸分子杂交技术简称原位杂交(insituhybridizatio

5、nISH)是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成带颜色的杂交信号，在显微镜或电子显微镜下进行细胞内定位。一、基因探针1）DNA酶切片段2）用PCR扩增出的核酸3）直接用RNA作探针4）人工合成（含标记）1.基因探针的类型2.基因探针的要求1）尽量避免高度重复序列：根据目的而定。最好用cDNA(要将polyA或polyT去掉)。2）G+C含量：40-60%3）探针本身不能有4个连续互补碱基，否则本身形成二级结构。4）不主张几个连续

6、相同碱基5）检测目的核酸时，要考虑模板出现率。（兼并性）6）探针比模板短：实际用长探针检测短模板的也可，不影响结果。3.核酸探针杂交所用的固相载体1）芯片：种类多，用于工业生产，见各公司介绍。2）硝酸纤维膜(NC膜)：吸附单链DNA、RNA能力强，80-100ug/cm2；也可非特异性吸附蛋白，但吸附率比核酸低。缺点：脆、易折断；不能吸附小片段DNA。3）尼龙膜：吸附DNA能力比NC膜强，也可吸附小至10bp的DNA。优点：易把模板固定在膜上；可反复使用多次。4）化学活化膜：用化学试剂把NC膜处理，可吸附极少量核酸。也可用普通滤纸。5）滤纸核酸杂交常用几种膜的性能比较硝酸纤维膜(NC

7、膜)硝酸纤维膜有两种;0.22µm孔经0.45µm孔经4.基因探针的标记物1）同位素：H3、S35、P32最常用（缺点：不能保存）2）非同位素：①地高辛：植物中提取。商品化地高辛标记dCTP，即合成链时，用地高辛标记dCTP。dCTP-地高辛与酶标抗地高辛抗体反应，加底物显色。②生物素-亲和素：用酶标亲和素测dCTP-生物素③荧光：送生物公司标记5.探针标记方法1）DNA的切口平移2）随机引物法3）单链DNA探针4）RNA探针5）DNA的5’或3’末端标记