猪带绦虫六钩蚴TSOL18抗原表位及组织定位的研究

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1、StudiesontheofTSOLl8ofTaeniasoliumoncospheresAijiangGuonoAdvisor：ProfessorXuepengCaiProfessorRunWuSubject：PreventiveVeterinaryMedicineCollegeofAnimalMedicine，GansuAgriculturalUniversity,LanzhouSubmissioninMay2010英文缩写aaAmpZsoliumbpDABgmgpgHI冲IgGBSAIPTGkDaLBMAbh

2、mlnSLmLpLmmolNCODOPDPBS英文缩略表英文全称aminoacidAmpicillinTaeniasoliumbasepairDiaminobclxzidinetetrahydrochlorideGrammilligrammicro-gramhorseradishperoxidaseimmunoglobulinGBovineSerumAlbuminisopropy-B-·D--thiogalactosideKilodaltonLuria-BertanimediumMonoclonalantibody

3、hourminutesecondlitermillilitermicrolitermillimolenitrocellulosefilterOpticaldensityOrtho—phenylenediaminephosphatebufferedsaline中文名称氨基酸氨苄青霉素猪带绦虫碱基对二氨基联苯胺克毫克微克辣根过氧化物酶免疫球蛋白G牛血清白蛋白异丙基一13一D--硫代半乳糖苷千道尔顿LB培养基单克隆抗体小时分钟秒升毫升微升毫摩尔硝酸纤维素膜光密度联苯二胺磷酸盐缓冲盐水伽5Ⅲ5Ⅲ2㈣0册4舢7Ⅲ川⋯川●-脚

4、YpHr／minSDSSDS．PAGETE"IrisVpowerofhydrogenrevolutionperminutesodiumdodecylsulfateSDS-polyacrylamidegelelectropheresisTris·C1．EDTAbufferTris-(hydroxylmethyl)一aminomethanevoltⅡ酸碱度[氢离子浓度的负对数]每分钟转数十二烷基硫酸钠SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳TE缓冲液三羟甲基胺基甲烷伏特猪带绦虫六钩蚴TSOLl8抗原表位及其组织定位的研究摘要囊尾蚴病

5、是由猪带绦虫的幼虫——囊尾蚴寄生于人或猪而引起的人畜共患寄生虫病，该病不仅给畜牧业造成一定的经济损失，而且还威胁着人类健康，是经济落后国家和地区重要的公共卫生问题。TSOLl8是猪带绦虫六钩蚴阶段特异性表达的抗原，主要在六钩蚴入侵中间宿主的早期阶段分泌，其免疫血清在体外能有效杀死六钩蚴，体外表达的重组TSOLl8能完全保护猪不被猪带绦虫虫卵感染。随着免疫学的发展，人们认识到有效的保护是抗原表位的参与。因此，阐明猪带绦虫TSOLl8蛋白的抗原表位和组织分布对于该病的新型诊断试剂以及分子疫苗设计方面意义重大。本研究挑取

6、实验室保存的重组菌株PichiapastorispPIC9K—TSOLl8进行5L发酵罐发酵培养，甲醇诱导72h后将表达上清液进行SDS—PAGE，用薄层扫描分析，目的蛋白约占上清总蛋白含量的80％以上，目的蛋白表达量达2．00g／L。重组蛋白TSOLl8经SephadexG一100分子筛凝胶层析纯化后，其纯度达90％，满足制备单抗的抗原要求。将纯化的TSOLl8作为免疫原，制备了12株可分泌TSOLl8单克隆抗体的杂交瘤细胞株，经分型试纸条鉴定，12株单抗分属于IgGl、IgG2a、IgG2b、IgM抗体亚型，轻

7、链均为K型；ELISA叠加试验表明，12株单抗分别识别2个不同抗原表位，2株不同抗原表位单克隆抗体的腹水效价分别达1X102和1X106；杂交瘤细胞株的染色体组型、单抗的稳定性等的分析表明，所获得的12株单抗均能稳定分泌，满足常规实验的要求。采用次氯酸钠溶液、胆汁和胰酶获得激活的六钩蚴，虫卵的脱壳率为95％，六钩蚴的活力为72％，然后用TSOLl8免疫的猪血清和TSOLl8单抗对激活的六钩蚴分别进行体外杀伤实验，台盼蓝染色判定六钩蚴活力。结果证实在有补体的情况下，多抗和单抗6天时对六钩蚴的杀伤率分别为73％和52％

8、。为了分析单抗的抗原结合位点，本研究利用TSOLl8单克隆抗体筛选噬菌体III随机12肽库，通过四轮“吸附一洗脱一扩增’’的亲和筛选，对噬菌体12肽库进行了富集。随机挑取的59个噬斑提取DNA后测序，根据测序结果推导出的TSOLl8单抗识别的表位氨基酸序列分别为ETTKLQRFQAML(L1)和DHTLF(L2)，两个序列出现频率分别是83％和15％。ELI