双链DNA芯片的制备及其应用研究

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1、中文摘要中文摘要论文题目：双链DNA芯片的制备及其应用研究博十研究生：向云飞导师姓名：陆锕宏教授学校名称：东南人学基田芯片由下其极高的检测通最，在基因组学、药物学、医学检验等领域中得到了越来越广‘泛的关注。DNA与蛋白质的序列特异性识别和相互作用在基冈表达凋控中发挥重要的作用。许多疾病的发生和发展都与DNA结合蛋白的异常相关。DNA结合蛋白的研究已越来越受到人们的关注，成为基因组和蛋白质组研究的重要内容之一。目前的DNA芯片主要是同定单链的寡核苷酸序列以实现对核酸序列的分子识别。DNA结合蛋白能够特异性的识别双链DNA序列，因此发展创新的DNA芯片技术．使之能够

2、商通量地研究DNA结合蛋向和序列特异性相互作_I{j是非常有意义的。本论文以序列特异性的DNA结合蛋白为研究材料，提出了一系列的新型双链DNA芯片，并用丁：DNA结合蛋白与靶标DNA的相互作用研究。利用双链DNA芯片，我们开展了一系列双链DNA与蛋白质相互作用的有关研究．它们包括：内切酶与同定化双链DNA的酶切、不同的单碱基突变或错配位点与NF．KB蛋向的亲和率的比较、出及发展了两种基u丁叔链DNA芯片的DNA结合蛋白的非标记检测方法。具体内容如下：1．双链DNA芯片的制备提出了三种双链DNA芯片的制备方法。方法一：同定的单链发卡结构探针，通过DNA聚合酶在片延

3、伸的方法，将单分子单链DNA分子转换为双链DNA分子；方法=：单链发卡结构探针通过与一段长链单链DNA片段杂交，然后通过连接酶连接后形成一条“u”型附单分子探针，将该探针同定后通过DNA聚合酶在片延伸的方法，将单分子单链DNA分子转换为双链DNA分子；方法三：直接固定一条具有同文结构的DNA探针，在片自复性后便形成发卡结构的双链DNA探针。与传统的双链DNA芯片的制备方法作了比较研究，实验结果中指出：传统的双链DNA芯片的制备方法，先固定的单链DNA分子后，杂交一段短的DNA分子，然后以该片段为引物在片延伸为双链DNA分子．由于在片复性效果不理想，影响了DNA聚

4、合酶的延伸，芯片点阵一致性较差，且信号较弱：而我们提出的三种单分子发卡结构探针，可以进行自身复性形成延伸引物，探针的复性和空间定位效果好，更有利于研究DNA／蛋白质的相互作用。2．双链DNA芯片的制备条件的优化为了能够更经济有效的制备双链DNA芯片，首先对发p结构探针的设计进行了～序列的优化，包括发}结构探针的旁侧序列、loop区碱基数以及同文互补碱基数的设计等。经过一序列的探针设计优化实验，我们可以得山以F发苦结构探针的设计原则：(1)较K的旁侧序列更有利于固定的DNA与蛋F=I质的结合，对于NF．KB蛋白不得少y-6个碱基；(2)发卡结构的互补序列不得小于4

5、个碱基，一般我们选择5个碱基；(3)在5个碱基的互补序列中，不肯有loop碱基同样也能达到理想的延伸效果。同时，我们将TaqDNA聚合酶代替KlenowDNA聚台酶延伸体系在片制备烈链DNA芯片，井对TaqDNA聚合酶延伸体系的反应温度及M92+浓度也相麻作了优化(50"C；}112．5raM的M92+浓度)。结果表明，_}{{TaqDNA聚台酶在相对较低的温度(50。C)年¨较高的Mg”浓度(2．5raM)条件F制备的烈链DNA芯片同样能够很好地虑熠于DNA／蛋白质相互作_}

6、=J的研究。3．内切酶与I)NA序列特异性的相互作用研究利用坝链DNA芯片同时对2种

7、内切酶与脚定的双链DNA探针进行了序列特异的酶切反戍。同时，我”J研究了甲基化修饰的同定化双链DNA探针，对其对应内切酶的酶切活性的影响。我们将该同定化的探针先进行了甲基化修饰后，然后用对应的内切酶进行消化。通过双链DNA芯片的方法，验证了经过其相应的甲基化酶处理过的双链DNA序列不再被内切酶进行识别和切割，而没有经过甲基化修饰的内切酶位V东南大学博．I：学位论文点能够被相应的内切酶识别并切割。这种结果进一步表明，按照不同需要制备般链DNA芯片可用于研究多个DNA／蛋白质序列特异性地相互作刚。这也预示烈链DNA探针通过在片生化修饰，能够_l{}j丁_DNA／转录

8、因子多步骤的基因调控研究。4．rhNF．KBpS0二聚体与DNA序列特异性的相互作用研究利用方法11制备了包含NF．rBp50二聚体蛋白识别的野生型结合位点以及所有可能发生的单碱基突变的结合位点的双链DNA芯片。通过比较不同结合位点与荧光标记的NF-r．Bp50二聚体的结合效率，每一个碱基对丁-DNA／p50p50蛋白质相互作用的重要性都得到评价。结果显示每个碱基对于这种结合亲和率的影响是不一样的。Gl、G2和C10巧对于pSDp50／lg．r．B的高亲和力的结合是最为重耍的，任何其他碱基的替代都会导致亲芹¨力的极人降低。相比较而育，G3、A4、T8和C9对于这

9、种高亲和力的结合的贡献就