三维凝胶DNA芯片热聚合制备及其应用研究

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1、中文摘要中文摘要论文题目：三维凝胶DNA芯片热聚合制备及其应用研究博士研究生：潘志强导师姓名：陆祖宏教授学校名称：东南大学基因芯片技术已成为近年米的研究热点，其高通量的平行性分析的特点受到了越来越多的关注。同二维凝胶芯片相比，三维聚丙烯酰胺凝胶芯片具有固定DNA能力高的特点，它已被应用于众多的研究领域。但是，目前制备聚丙烯酰胺凝胶芯片的方法仍然存在较多缺点，如制各速度慢、芯片易污染以及信噪比较低等。本研究发展了一种制备聚丙烯酰胺凝胶芯片的新方法，提高了凝胶芯片的信噪比，建立了基丁二凝胶芯片的SNP检测平台。此外，还成功地发展了一种用于焦测序的单链DNA模板凝胶制备技术，初步建立了芯片

2、固相焦测序平台。1．热介导法制备聚丙烯酰胺凝胶芯片我们发展了凝胶芯片的热聚合制备法。我们发现，将不会凝集的预聚物(包含PCR产物，1．4％过硫酸铵，6％丙烯酰胺，20％甘油和平衡水)点样到芯片上，通过直接对预聚物芯片80℃加热2min，可以实现三维凝胶芯片的快速制备。本研究优化了PCR产物凝胶芯片的制备条件，提高了DNA的固定效率和芯片制备的质量，研究了凝胶芯片上进行单碱基或多碱基错配检测的条仲。实验研究结果表明，与现有凝胶芯片制备方法相比，该方法具有制备简单、快速、无需激发剂四甲基乙二胺等优点。此外，PCR产物可以直接被用于凝胶芯片制备中，从而节省大量PCR产物纯化的时间和避免PC

3、R产物可能的污染。2．三维凝胶芯片在SNP分型上的应用我们应用热聚凝胶芯片，研究了Y。氨基丁酸A受体的p2基因(GABRB2)两个单核茁酸多态性(sNP)位点(包括194072A／G位点和252944C／G位点)的基因分型。首先，运用等位基因特异探针杂交法对凝胶芯片上54个靶标DNA进行了SNP分型检测。实验结果表明，热聚法凝胶芯片能够准确地对试验样本进行检测，试验结果获得了进一步测序验证。我们还发展了热聚凝胶芯片等位基因特异延伸技术进行SNP基因分型方法研究。但是，该方法中仍有一些引物一模板问的碱基错配如G：T、C：A等容易发生错配延伸现象，这样容易造成了SNP检测信号的假阳性问题

4、。为解决这个问题，三磷酸腺营双磷酸降解酶(apyrase)介导的等位基因特异延伸反应被应用于SNP基因分型的检测。借助该降解酶能够有效阻I}：或减慢错配的引物．模板之间的延伸反应，提高了延伸法检测SNP分型的特异性，实现了对多样本的GABRB2基因194072A／G位点SNP的正确分型。该研究进一步提高了热聚东南大学博士学位论文凝胶芯片利用延伸法进行SNP分型的准确性，为热聚凝胶芯片的SNP分犁应用奠定了坚实的基础。热聚凝胶芯片还具有较高的应用潜力和拓展空间，如突变研究、甲基化检测以及凝胶同相PCR等。3．低频超卢提高凝胶芯片信噪比对于三维凝胶芯片来说，聚丙烯酰胺凝胶是一种具有多孑L

5、结构的DNA支持介质。虽然该结构提高了DNA固定能力，但是由于多孔结构对杂交荧光探针具有强烈吸附作用，又会造成了凝胶芯片较高的背景噪音。本研究采用了低频超声快速清除非键合探针的技术，很好地降低了凝胶芯片背景，提高了凝胶芯片的信噪比。实验中对超声条件和杂交探针特性进行了研究，发现适合超声法处理凝胶芯片的报告探针适合长度为13碱基，超声的较好条件是15℃处理35sec。上述条件下，凝胶芯片的信噪比能获得了很大提高。最后，应用该技术对具有114个样本的凝胶芯片进行了处理。实验结果表明，低频超声的方法能够有效提高凝胶芯片的信噪比，满足多样本凝胶芯片进行基囚分型高灵敏度的要求。该技术为三维凝胶

6、芯片提高信噪比提供了一种高效、快速的新方法。4．三维凝胶芯片在焦测序中的应用焦测序是一种新的重要的测序方法。高质量低成本的测序模板制备是获得准确测序信号的保证。目前制备焦测序单链DNA模板的方法有酶消化法和磁珠或琼脂糖珠子法。酶消化法需要对PCR产物中的所有干扰因素，如过剩扩增引物、dNTP和焦磷酸等进行完全消化以消除对测序信号的干扰，该方法成本较高且很难获得理想的单链DNA测序模板。磁珠或琼脂糖珠予法虽然能够获得的模板量较大，但成本仍高且需要特殊的装置。为此，本研究借助热聚凝胶法为焦测序制备了凝胶同定的DNA测序模板。试验过程中，将PCR产物直接混合到凝胶预聚物中，通过对其加热聚合

7、后，再将凝胶同定的双链DNA变性，即可得到焦测序单链DNA模板。试验结果表明液相焦测序中能够获得高质量的测序信号。利用该方法制备的DNA模板，GABRB2基因194072A／G的SNP位点的样本被准确进行了测定。该技术提供了一种低成本焦测序模板制备方法。另外，本研究还发展了一种凝胶芯片固相焦测序方法，即将固定有DNA凝胶点在光纤芯片上制备成多阵列，然后通过在芯片上进行的焦测序反应实现对芯片上待测DNA序列的测定。目前已应用该方法对2x2阵列上多个碱基序列进