镉诱导仔猪睾丸支持细胞氧化酶活性降低及DNA损伤的研究

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1、生态环境学报2010,19(3):576-579http://www.jeesci.comEcologyandEnvironmentalSciencesE-mail:editor@jeesci.com镉诱导仔猪睾丸支持细胞氧化酶活性降低及DNA损伤的研究1，2111111*张明，邬静，邓思君，袁莉芸，郭诚志，朱丽，袁慧1.湖南农业大学动物医学院，湖南长沙410128；2.江西生物科技职业学院，江西南昌330200-1摘要：以仔猪睾丸支持细胞为实验模型，采用二步酶消化法分离支持细胞进行培养。探讨了0、10、20、40、80µmol·L的-1氯化镉对支持细胞的

2、毒性作用。结果表明：10µmol·L以上的氯化镉有抑制支持细胞生长的作用，并能使支持细胞氧化酶活性下降，造成支持细胞DNA损伤。关键词：氯化镉；支持细胞；氧化酶；DNA损伤中图分类号：X171.5文献标识码：A文章编号：1674-5906（2010）03-0576-04镉是一种重金属,对动物和人具有诱变畸形和1.3试验分组和MTT细胞抑制试验致癌作用,特别是对肾、睾丸、肝等组织具有毒性作A组为对照组，不含氯化镉的DMEM/F12。试-1用,被美国毒理委员会(ATSDR)列为第六位危及人验组为B、C、D、E组，分别为含10μmol·L、20[1]-1-1-1

3、体健康的有毒物质。它可伴随饲料添加剂氧化锌μmol·L、40μmol·L、80μmol·L氯化镉的培养基。[2]进入动物体内,引起动物繁殖能力下降。由于镉是24h后收集细胞进行试验。重复4次。MTT细胞抑制[5,6]半衰期很长(20年以上)的多器官、多系统毒物，容试验参照文献。易蓄积，不易分解，所以对动物、人和食品安全构1.4SOD,MDA,GSH-Px的检测成了渐进性威胁，并且因为镉的残留造成对的环境SOD、MDA、GSH-Px的检测的检测参照南京[3]污染。镉的生殖毒性的研究大都是对生精细胞。建成试剂盒检测。但镉对睾丸支持细胞，特别是猪睾丸支持细胞毒性

4、1.5支持细胞DNA损伤的检测[7]研究国内外罕见报道。本试验以体外培养的仔猪睾参照Singh的方法,稍加改进。裂解时间延长为丸支持细胞为实验对象，进行了本研究。2h。解旋时间1h，电泳时间为40min。玻片置荧光1材料和方法显微镜下观察，DNA损伤级别参照Singh方法。每1.1仔猪睾丸组共分级计数400个细胞，(每组做4个平行片，每片睾丸采自湖南长沙本地3～4周龄仔猪,置于冰计数100个细胞)。紫外光激发，DNA图像成桔红色，-1浴PBS液(含双抗600IU·mL)中，2h内送至实验室。可清楚观察到核DNA和迁移的DNA，即彗星尾。1.2支持细胞的分离

5、、培养和鉴定用SPSS12.0forWindows软件对各组所得的数[4]在MauroMaccarrone方法的基础上加以改据进行统计分析。进。将仔猪睾丸无菌剪除附睾等其他组织，剥离被2结果和分析3膜和曲细精管,再将睾丸组织剪成1~2mm的小块。2.1支持细胞-1-1采用1g·L胶原酶和2.5g·L胰酶进行消化。收集细采用二步酶解法分离后的支持细胞大约占活胞重新混悬于培养液中,采用自然沉降和低速离心细胞总数的90%以上，胞培养24h后支持细胞呈宽法去除血细胞和间质细胞。用0.4％苔酚蓝染色鉴定大的柱状或不规则形，胞体大且拉长，细胞贴壁铺6-1细胞活率。调整

6、细胞密度至2×10mL进行培养,培展，相临细胞交织连接，呈镶嵌状排列，细胞间隙养液为含10％胎牛血清的DMEM/F12。培养条件为不规则，两侧多有多个突起，折光性较强在胞质中34℃，5％CO2和100％湿度。24h后吸去培养液，可见吞噬物和大小不等的空泡，细胞胞核也可以见-1用20mmol·L的Tris-HCl处理5min去除精原细胞。到。油红O染色显示,在支持细胞胞质的两极或散布换新培养基培养。等细胞铺满底80%~90％后用油红于核的四周出现红色圆形脂肪滴（见图1）。免疫O和免疫细胞化学方法进行鉴定。细胞化学表明,培养72h的细胞中高度表达FasL(见基

7、金项目：湖南农业大学青年基金项目(07QN06)；湖南农业大学动物医学院青年基金项目(BK0718)作者简介：张明（1969年生），男，教授，博士研究生，主要从事中毒和毒理学研究。E-mail:zhming1970@yahoo.com.cn*通讯作者：袁慧。E-mail:yuanhui7629@yahoo.com.cn收稿日期：2010-01-17张明等：镉诱导仔猪睾丸支持细胞氧化酶活性降低及DNA损伤的研究577表1氯化镉的对睾丸支持细胞抑制率的影响Table1CellactivitiesofpigSertolicellswereassessedbyMT

8、Tassay组别OD490抑制率/％A0.757±0.0360*B