《磷酸钙系新型骨修复复合材料的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
磷酸钙系新型骨修复复合材料的研究生物医学工程专业博士研究生周大利指导教师郑昌琼骨组织工程复合材料至少包括两个最重要的组成部分：支架材料和种子细胞(或者因子)。种子细胞通过体外和体内增殖、分化和分泌胞外基质构建新的骨组织，骨形态发生蛋白(Bonemorphogeneticprotein，BMP)能够异位诱导间充质细胞分化为软骨和骨细胞，支架材料提供新骨组织形成所需的临时空间和力学支持。因此种子细胞及因子的选择、扩增和支架材料的研制是骨组织工程的关键。本文迸行了BMP／a—TCP骨水泥、rhBMP．2／B—TCP陶瓷、兔骨髓基质细胞／B—TCP陶瓷、B—TCP／PLLA与大鼠骨髓基质干细胞复合及B—TCP／PLLA与大鼠骨膜成骨细胞复合几个体系骨组织工程复合材料的研究。本研究首先开发了制备高性能的13一磷酸三钙(tricalciumphosphate，TCP)、n—TCP超细陶瓷粉及高性能多孔B—TCP陶瓷新工艺。将自制高纯、超细CaCO。用去离子水调和成浆料／JnA．到分析纯磷酸配制成的一定浓度的磷酸溶液中反应，配料按Ca／P原子比为1．50。反应在搅拌和超声波震荡下进行，并在十分钟内完成，制得组成为Cas(PO,)：nH20的TCP前驱体沉淀，该沉淀粒度细(0．8一几pm)而均匀，过滤性能优良，固液能快速分离。在1170℃下煅烧TCP前驱体制备B-TCP超细陶瓷粉料，在1230℃下煅烧TCP前驱体制备Q—TCP超细陶瓷粉料。TCP前驱体沉淀用3％PVA溶液作粘结剂，20—30目的柱状硬脂酸作成孔剂，经压模成型、干燥、在1170℃下煅烧制得高性能多孔B—TCP生物陶瓷。研究表明，CaCO，粒度对TCP前驱体粒度、陶瓷的孔隙率、抗压强度以及溶解速度均有影响，根据临床应用需要可以通过选用不同CaCO。粒度及致孔剂形状大小来调节陶瓷的孔隙率、孔结构，以控制陶瓷强度和溶解速度。该新工艺制备的高纯微细n—TCP粉体具有优良的凝结性能和水化性能。自I 制高纯微细磷酸氢钙(DCP)、CaO(d。分别为1．72和1．2llT11)为辅配料，摩尔比为：d—TCP：DCP：CaO=O．95：0．025：0．025，用0．25MNaH2POJNazHP04混合液调和，其初凝时间为7分钟，终凝时间为35分钟，在Bank’S溶液里浸泡5天其抗压强度可达到35MPa，达到了颅骨修补材料的强度要求。用Urist法自小牛长管状骨中提取部分纯化的活性BMP，将BMP与a—TCP固相粉体按比例混合均匀后再与液相反应，制成BMP含量不同的BMP／n—TCP磷酸钙骨水泥复合材料。分别采用单纯Q—TCP和BMP含量不同的BMP／a—TCP修复成年兔较大颅骨缺损，4周时可见蹦P／d-TCP材料内大量类骨组织生成并见少量钙沉积；8周时新骨量增加，钙化更多、强度明显增加；16周骨组织进一步成熟，骨缺损由新骨桥连修复。而Q—TCP组8、16周时骨生成量和强度均低于酬P／Ⅱ一Tcp，骨缺损区未形成新骨桥连，但软组织量却明显多于后者。16周时BMP／n—TCP和a—TCP的材料吸收量基本相等。本研究将多孔B—TCP和重组人的骨形成蛋白一2(recombinanthumanbonemorphogeneticproteins一2，rhBMP一2)复合，制得rhBMP一2／S—TCP复合人工骨材料，将其植入小鼠肌肉内，观察复合物的骨诱导和降解能力。72小时可见幼稚软骨，1周见成熟软骨，2周编织骨和少量板层骨，3周和4周成熟的板层骨生成，对照组则无骨或软骨生成。2周开始间充质细胞和纤维组织长入材料，3--4周将材料包裹分割，同时可见多核巨细胞反应及吞噬现象，这些是降解早期组织学改变。兔骨髓基质细胞(MSC)在本研究制备的多孔B—TCP表面贴壁生长状态良好，并合成大量胶原纤维，胶原的合成量也较多，表明本研究制备的B—TCP载体具有良好的生物组织相容性，可将B—TCP载体复合MSC制得BMP／B-TCP复合材料，应用于骨组织工程。本论文采用溶液浇铸～模压成型一沥滤三步法研制成具有一定孔隙率、孔径的B—TCP／PLLA多孔复合材料，详细地研究了材料的组成和孔隙率等因素对该复合材料力学性能的影响。结果表明：B—TCP／PLLA多孔复合材料的压缩强度和模量随孔隙率的增加而大幅度的降低。低孔隙率(小于70％)时，可以通过改变材料的成分比例和$-TCP的粒径来改善材料的力学性能。而高孔隙率时，材料的力学性能较差，且基本不受成分比例和O-TCP的粒径影响。体外和体内实验表明，经成骨诱导的骨髓基质细胞和骨膜成骨细胞在B—TCP／PLLA多孔复合材II 料能够粘附、增殖、分化，表现出正常的生化功能，B—TCP／PLLA多孔复合材料具有成骨传导性，是骨组织工程支架材料的较好选择。而相对与成骨细胞来说，经成骨诱导的骨髓基质细胞是种子细胞的较好选择。因此可以认为：以B—TcP／PLLA多孔复合材料为细胞支架、经成骨诱导的细胞为种子细胞的复合材料是新型的骨组织工程骨缺损修复材料。关键词：置组终工猩置笪基廑王细照置形态筮生蛋自重组厶的置堑盛蛋自二2生物复金挝魁磷酸鱼生塑活性置盔渥嚣L二乳酸宦二鳢酸三鱼!二磷酸三鱼IlI Studiesonthenewtypebio—compositesofcalciumphosphatesystemforboneprosthesiSBiomedicalEngineeringspecialtyDoctoraIcandidateZhouDaliSupervisotZhengChangqiongMostbonetissue·engineeringcompositesarecomposedofatleasttwobasiccomponents：seeding·cells(orfactors)andscaffoldmaterials．Thecellularcomponentisnecessaryforthelgenerationofmatrixandisresponsibleforthelong—termmaintenanceofthismatrix．Bonemorphogeneticproteincaninducemensenchymalcellstodifferentiatetocartilageandbone—cellsinseparateplace．111escaffoldmaterialsprovidemechanicalstabilityandmaintainathree—dimensionalspacefortheformationofnewbonetissuewimappropriatestmctI鹏．Soitispivotaltotheseteetseeding—cellsandthescaffoldmaterialsforbonetissueengineering．Anewpreparingprocessofe-tricalciumphosphate(13-TCP)，Q—TCPultratinepowdersandporous8-TCPbioactiveceramicshasbeenstudiedinthepresentthesis．High-purityandultrafineCaC03powdersweremixedtoslurrywithwaterandphosphoricacidisdilutedtosolution．111eamountofCaC03andH3P04wasaddedaccordingtoCa／P=1．50．ThenCaC03slurrywaspouredintophosphoricacidsolutionquicklyinnormalatmospherictemperature，stirringphosphoricacidsolutionandultrasonicagitation．Finally,high-purityandultrafineCa3(P04)2nH20wassynthesized．The13-TCPultrafinepowderWaspreparedbycalciningCa3(P04)2nFl20at1170。C．111ea—TCPultrafinepowderWaspreparedbycalciningCa3(POD2nH20at1230"(2．UsingPVAsolutionasstickingagentandcolumnarfatty‘acidasmakingporeagent，theporous13一tricaciumphosphatebioactiveTV ceramicswerepreparedbysinteringprocessat170℃．Thehavecross-columnarholesinsideandhigherstrength，whichadsorbandreleasethebonemorphogeneticprotein(BMP)easily．ThehavegooddissolvableabilityandofferabundantCaandPelementsfort}1enewbone．Accordingtoadjusfingholeconstructionandporosityof．theceramics，thestrengthanddissolvablerateoftheCallbecontrolled．Thehigh—purityultrafineⅡ-TCPpowderproducedbythenewproeesshasexcellentsettingpropertyandhydratingproperty，Theassistagentsarchigh—purityultrafmeDCPandCaOself-produced．MolratioisⅡ一TCP：DCP：CaO=0．95：O．025：O．025。Themixturepowdersweremixedwith0．25MNaH2POdNa2HPO,．Theirinitialsettingtimeisabout7min，thefinalsettingtimeisabout35rain．Thecompressivestrengthreached35MPaafter5daysimmersedinHartk'ssolution．ItWasenoughforrepairingskulldefects．ByusingUristmethod，apartlypurifiedactiveBMPWaSextractedfromone-year-oldsteerslongtubularcorticalbone．BMP，CI-TCPpowdersandassistagentsweremixedwithliquidphase．ThreekindsofmaterialswhichwereB^量P／a一丁CPcompositesofcontaining】％．2％B知fPanda—TCPcementalonewereseparatelyused"torepairlargeskulldefectsofadultrabbits．Afteroperating4weeks，osteogenesisandafewcalciumsedimentswereobservedintwoBMPtfl-TCPcomposites．弧issituationwasenhancedafteroperatinggweeks。BonetissueWasmorematureandboneunionWasformedafteroperatingt6weeks．BycontrastwithBMP／q-TCPcomposites，Osteogenesisandcalciumsedimentswere】owerjna-TCPcementsaloneandboneunioncouldnotbeformedafteroperating16weeks．TheBMP／Q-TCP-Bcementwasthemostpotentactivatorofosteogenesis．However,theresorptionofmaterialsinCI—TCPcementalonew醛almostthe$81me船BMP／n-TCP(B1．Porous13-rtricalciumphosphate(B·TCP)Wascompoundwithrecombinanthumanbonemorphogeneticproteins-2(rhBMP一2)．1rt豫rhBMP／B-TCPcompositehasbeenobtained．Thecompositeswereimplantedintothemusclesofthethighofmice．Theabilityofboneinductionanddegradationofthematerialshasbeenobserved．111eimmaturecartilagewaSfoundaffter72hours，thematurecartilageV after1week，thewavebones2weeksandthelaminarboneswithbonemarrow4weeks．Noboneorcartilagewasfoundincontrolgroup．Theearlystageofdegradationwasfound，whichwasrepresentedbythephenomenonoffibroustissuesandmensenchymalcellsinvadingintothematerials2weeksandthematerialssurroundedanddividedintosmallpieces3and4weeks．ThemultinucleatedreactionandphagocytosiswasfoundedalsoatsalD．etime．RabbitsMarrowstromaleells(MSC)grewverywelladhibitedinthesurfaceofporous13·TCPbioactiveceramicspreparedbyUSandproducedalotofbonecollagen．Fromtheresults，Weconcludedthattheporous13一TCPbioactiveceramicspreparedbyUShavegoodbiocompatibilityanditCanbeusedtobonetissueengineering．Inthepresentthesis，aprocessconsistingofasolventcastingstage，acompressionmoldingstageandaleachingstagehasbeenusedtofabricatemacroporonscompositeofpoly(L—lacticacid)(PLLAljan／8一tricalciumphosphate(13-TCP)．Theeffectsofwei．ghtfractionofporogen—NaCI．weightratioofPLLA：B—TCPanddiametersof13-TCPontheporosities。theaverageporediameters，thecompressiveyieldstrengthandcompressivemodulushavebeenstudied．Theresultsshowedthatwiththeincreaseinporositiesandtheaverageporediameters，thecompressiveyieldstrengthandcompressivemodulusdecreasewhentheweightfractionupfrom50％to90％．ThecompressiveyieldstrengthandthecompressivemoduluscouldbeimprovedbychangingtheweightratioofPLLA：13·TCPanddiametersofB-TCPinlow-porositycomposite(10werthan70％)．However，high-porositycomposites(90％)werenotreinforcedbychangingtheweightratio．ThestudiesinvitroandinvivoalsoshowedthatrMSCsandosteoblastswereattached，proliferatedanddifferentiatedOn13．TCP／PLLAcomposites，andrMSCsexhibitedbetterosteoblasticdifferentiation册B·TCP／PLLAcompositesthanthatOnthematerialsonlycomprisedofPLLA．Fromtheresults，ithasbeenshowenthatthetissue-engineeringbonewhichconsisting-TCP／PLLAcompositesasscaffoldandMSCs髂seeding—cellsisapromisingboneprothesismaterialsforbonedefect．VI Keywords：垦盟￡!i§§丛§￡旦gi坠￡§亟ngM堑殴型堕箜里匦§鲤里￡￡!!§iMS￡§l旦Q盟也Q盟№g§坠鲢地p盟坦也f．旦丛里．1旦iQ￡Qn望Q§i丝Recombinanthumanbonemorphogeneticproteins-2(rhBMP-2)．．．．．．．．．．．．．．．．．．——CaciulmphosphatebioaetivebonecementsPolv(L-lacticacid)(PLLA)一13-tricalciumphosphate(13-TCP)a-tricalciumphosphate(a-TCP)——VII 四川丈学博土学位论文第一章前言1．1骨的化学成分与作用1．1．1骨的作用及骨缺损骨骼是人体重要的组织和器官。它在人体中起着支架作用，担负着支持身体、保护其它器官、承重、造血、贮钙、代谢等功能。骨骼的剐度是肢体功能的基础，骨骼是肌肉运动的杠杆、关节活动的支柱，它使机体受力后得以支持而无明显变形。理论上，骨缺损是指由于某种原因骨折端丧失了～些骨质而形成的间隙h3，它在临床上十分常见，可由多种因素引起，如创伤、骨肿瘤瘤段切除之后、骨组织炎症及先天性缺陷等。长时闯过度牵引、不恰当的固定及肢体延长术引起的骨折端分离等骨折的分离移位也可以认为是一种骨缺损。由于骨缺损形成的骨闯隙阻碍了骨细胞的爬行，因而不能发生正常豹愈合过程，一般只能在骨缺掼区域形成纤维组织充填，造成骨不连接，使骨愈合效果不好。除了某些血运较好郝位且，』、的骨缺损(如糨隆间骨钎)可以靠骨折端周围的骨膜及骨髓等组织的成臂作用愈合外，大块骨缺损的愈合是十分困难的。这主要因为：(1)骨折端分离使骨缺损间隙内缺乏骨诱导物质，如骨形态发生蛋白(bonemorDhogeneticprotein。嘲Ps)等；(2)周围组织塌陷，填入骨缺损间隙，使成骨细胞难于爬过问隙与对侧成骨细胞会师在骨折两端及间隙内共同成骨，也阻碍了骨折端两儇4的骨痂桥接，并使骨折端形成骨性膨大。因此作为骨不连的一个特例，临床上对于骨缺损引起的骨不连的治疗比其它类型的骨不连更为困难，有时大块骨缺掼甚至可以导致瘸人肢体残废。临床上常采用骨修复或骨移植手术治疗骨缺损疾病。骨缺损是一类最常见的疾病，我国每年涉及骨缺损疾病的患者多达数百万人。3，对修复骨缺损最有效的方法——骨移植有着巨大的需求。就应用数量和频率而言，骨移植术已成为仅次于输血的人体组织移植。1。1。2毋的鸯机质骨由有机质加无机盐和水组成⋯。其中有机质占成熟骨干重的35％，主要为胶原；无机盐占65％。但对湿骨而言，有机质占其重量的22％，无机盐占46％，水分占32％。骨中有机质主要成分为成骨细胞合并分泌的胶原纤维，即骨胶原 旦查型!堕墼塑墨堑型量堡星墨全塑整塑塑垒(boneeollagon)，以及少量的无定型基质和极少量的肽类、脂类和某些特定成分。骨胶原为【型胶原蛋白和少量的V型胶原蛋白。基质可能与骨的钙化有关，在胶原纤维之间供应分子桥结，对基质的水化起调节作用。骨基质在存活骨中呈湿润状态，在所有基质中可以保持或释放水分。骨的形态发生蛋白(BMP)是一种与骨细胞分化有关的糖蛋白，属于骨基质中的非胶原蛋白。实验表明，BMP无论在离体或活体都作用于形态上菲特异的间充质细胞，并与骨生长因子有协调作用。近年来，通过对骨诱导机制的研究发现，BMP的主要作用是血管周围的闻充质型细胞分化为骨和软骨，目前已被认为是很有前途的促进骨形成的一种物质。j．1．3骨的无机质羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)的化学分子式为Ca。。(P04)。(OH)。，是品格常数为a=O．9432nm，c=0．6881nm的六方正交棱柱晶体。多晶羟基磷灰石具有很高的弹性模量(40—117GPa)，理想的钙／磷摩尔比为lo／6。计算密度“1为3．2199／cm3。骨骼中的磷酸盐不同于化学计量羟基磷灰石，它是一种直径约5～20nm，长约60nm的针状且结晶不完善的晶体，为钙／磷摩尔比在1．67-1．5范围的非化学计量羟基磷灰石(又称为碳酸盐羟基磷灰石)01。是指在羟基磷灰石中包含有CO。’、F‘、Na+等杂质的一种磷酸盐“3，其主要杂质成分为碳酸盐“1，占无机盐重量的5～8％，其它杂质含量微小嘲(见表1．1)。表1．1骨组织无机成分Table1．1Inorganicingredientafbonetissue(注：表中数据为重量首分数：★裹示mg／kg)骨组织的特点是其细胞问质中含有大量的磷酸钙盐，因此。是一种极其坚 四』II大学博上学位论文硬的结缔组织，骨组织中钙、磷离子不断更新，必要时可以通过细胞活动大量进入血液，也可将过量的血钙、血磷贮存于骨，从而参与肌体的钙、磷代谢。1．2临床上对骨替代材料的要求1．2．1治疗大块骨缺损传统的方法手术中使用的移植骨主要起成骨传导作用：即以移植骨为支架，使宿主的血管和细胞进入移植骨内形成新骨，同时移植骨逐渐坏死被吸收，并逐渐被新骨替代，重新建立组织的血运系统，使无生物活力的移植骨变成具有正常代谢的骨组织。治疗大块骨缺损传统的方法是：(1)将骨折端修平，对位，固定，使其愈合91。这种方法人为地消除缺损，但确造成肢体短缩或骨折部位的外形变化，以牺牲肢体长度换取骨折愈合，这对于负重的肢体来说必将影响其功能，故仅适用于上肢骨缺损的治疗；(2)用自体骨移植填充骨缺损。自体骨移植效果很好，但无论是自体松质骨移植还是皮质骨移植，均需手术取骨，给病人造成医源性创伤，而且取骨量有限，故仅适用于较小的骨缺损的治疗：(3)同种异体骨移植填充骨缺损。移植后的同种异体骨仅起到支架作用(即骨传导作用)，而无骨诱导活性“⋯，因为既使是新鲜的同种异体骨，移植后其自身的成骨作用也是无效的。移植骨本身的成骨细胞虽具有早期成骨能力，但宿主免疫排斥反应将清除移植骨中供体来源的细胞，早期的成骨亦将被吸收a同种异体骨的诱导活性也只有在将其脱钙后才能表现出来““，而脱钙又失去了异体骨的机械支撑作用，此外又由于宿主与供者组织相容性抗原的差异性，部分同种异体骨移植将发生延迟连接或不连接，甚至移植骨本身被迅速吸收““；(4)异种骨移植填充骨缺损。异种骨必须经过去抗原处理方能使用，BMP重组和纯化技术的成熟增加了异种骨在治疗骨缺损方面的使用价值。从骨形成的生物学特性来看，理想的骨移植物应包括三种要素：骨生成性、骨传导性和骨诱导性““。骨移植的基本研究内容是：(1)选择理想的骨移植材料；(2)评价骨移植材料的骨修复效果；(3)观察骨移植材料与宿区对骨愈合的作用；(4)研究骨移植材料与宿区的关系；(5)研究骨移植材料促进骨愈合的机理：(6)探3 周天荦j：磷酸钙系新型骨修复复合材辩豹研究讨新生骨形成的过程和机理。目前，已得到公认的是，标准的骨移植应该能修复骨缺损区，并最终达到结构和机械性能上同宿区的骨组织～致。骨移植材料应有足够的强度、有潜在的活力，在组织牛无不良反应(无毒，无免疫暴性，不致癌，不致畸)，有一定空间占位作用(支架作用)。此外，应该无菌、不携带任何病毒(如乙肝和爱滋病病毒)、可贮备，操作技术简单，可以控制生长、美观、可塑形。但是，对于材料的最终选择并不一定要完全满足于上述要求。如前所述，新鲜自体骨避免了免疫排斥反应，同时提供了细胞和组织生长的最佳生化环境。是目前最理想的修复材料，但来源有限、二次创伤和难以成型，限制了它在临床上的广泛应用““：虽然可以采用冻干、脱钙或辐照的方法减少异体骨酌免疫排斥反应，但由此产生的骨结构破坏和病源的引入是其固有的弱点“”：1．2．2骨组织工程技术为治疗大块骨缺损提供一条崭新途径随着材料科学和生物科学的发展，在本世纪六十年代兴起的组织工程学这门新兴学科为最终解决由于组织或器官缺失或功能衰竭而威胁病人健康甚至生命这一难题找到了方法，即研制用以恢复，保持和改善组织功能的生物替代品““。它由三个基本要素构成：(1)生物组织的基体材料：(2)具有特定功能的组织细胞(亦称工程细胞，engineeringcellS)；(3)调节细胞增殖分化的细胞因子。这三个要素协调组装的生物替代品(亦称细胞复合体，cellularcomposites“”)不仅具有被替代组织(或称目的组织)的功能，而且与机体本身具有良好的组织相容性。不发生排斥反应及其它不良反应。目前各国学者已在尝试组建哺乳动物体内的任何组织，在人体包括来源于内胚层、中胚层和外胚层的各种组织。在骨科领域，近年来骨组织工程学研究利用了人们在探索成骨理论与实践方面的一切成果，取得了许多令人瞩目的进展，使人们看到了治愈骨缺损，特别是长骨节段性骨缺损(>Scm)的曙光。理想的骨组织工程载体应具有以下特点：(1)材料本身无毒性。是工程细胞(即成骨细胞)贴附生长，增殖分化的适宜底物，并有一定的力学强度。为工程细胞发挥功能(成骨作用)提供支架(骨传导作用)；安全评价包括细胞毒性试验、急性全身中毒性试验、亚慢性毒性试验、溶血试验、过敏试验、刺激试验、体内试验、血液相容性试验、皮内试验、生物降解性试验、遗传毒性试验、致癌试验、生殖发育毒性试验、药物动力学4 ——一一一一．婴型奎兰竖圭兰垡堕塞试验等。(2)也可作为信号分子载体释放系统调节工程细胞的功能(包括信号分子的骨诱导作用)；(3)能降解。降解产物无毒性，不蓄积，不致癌，降解速度和载体内成骨速度相适应，以使新生骨组织在组织学和力学上最终取代载体；(4)有利于新生毛细血管的长入，适合营养物质，代谢产物及载体降解物质的分散吸收。为了达到最佳的成骨效果，骨组织工程学用于作为载体的材料方面的研究主要集中在以下三个方面。1．2．2．1探索具有良好生物相容性可降解的生物材料经过多年的探索人们发现性能较好的骨组织工程载体材料主要有以下三类：(1)天然载体材料。部分脱钙骨、脱蛋白骨及生物骨载体、天然珊瑚“”等，这类载体材料的特点是作为一种生物组织其无机成份和有机成份比合成的生物材料更符合异种生物体的骨组织结构，来源广泛，价格低廉。大量研究表明，如果能克服同种异体骨的抗原性，则同种异体骨将是一种良好的骨生物替代材料“””。1972年，PLENKo”首次使用异种脱蛋白骨复合自体红骨髓，移植修复大鼠骨缺损获得成功。目前最常用的是去抗原牛松质骨。”载体，它具有天然的多孔结构，微孔规则，相互贯通。Salama等嘲’“1利用其这～特点体外组装红骨髓成功治疗多例骨缺损与骨不连。第四军医大学全军骨科研究所利用牛松质骨载体与纯化的牛BMP复合组建的重组合异种骨(RBX)，经实验观察证明它适合于体内间叶组织的长入并发挥成骨作用，具有良好的组织相容性，RBX已应用于I临床治疗骨缺损、骨不连03’“2”。多数学者认为，部分脱钙骨比不脱钙骨有更强的骨诱导能力，可能因为脱钙骨能够将成骨诱导因子释放出来，使脱钙骨能更挽的被新骨替代蕊“。而对异体骨进行脱脂处理，可以除去脂肪、细胞膜脂蛋白等特殊细胞表面抗原，增强了骨的成骨能力⋯1，并且延长脱脂时间有利于抗原脱除。“。另一方面，对新鲜异体骨进行深低温、尤其是冷冻干燥处理，也可以明显降低异体骨的抗原性，以致于不能刺激受体形成抗HLA(有核细胞表面组织相容性抗原)抗体，临床应用时，无须用免疫抑制剂，也无须作组 周大利：磷酸钙系掰型骨修复复合材料的研究织相容性抗原配型‘3“。(2)高分子材料类。应用于骨组织工程的高分子材料主要是聚己P嘴(PCL)、聚乳酸(PLA)、及聚乙醇酸(PGA)[33-36]o此外，对于其它类型的聚合物，如聚对二氧六环聚(poly—dioxanonesynthetic，PDS)、聚原酸酯(POE)、聚酸酐(PA)、聚磷氰、聚氨基酯和“拟”一聚氨基酸等的合成及其应用进行了广泛的研究，并获得了大量的成果。然而，在众多的合成高分子中，PLA和PGA的应用和研究最广泛。PLA包括三种立体构形：聚右旋乳酸(PDLA)、聚左旋乳酸(PLLA)、和聚消旋乳酸(PDLLA)；PLLh和P吼A的结晶度～60％，Tg、Tm分别为58、215℃：PDLLA为无定型非晶态，Tg为58"C，无熔融温度““。BreitbartAS等用多孔的PGA载体与体外增殖的兔自体骨膜成骨细胞复合成功地修复了兔颅骨的直径为1．5cm全层骨缺损啪1。此类载体的特点是低、中分子量及分子量多为分散性较大的高分子聚合物，降解时产生聚合物碎片、寡聚物及单体等酸性物质较多，易于引起局部组织反应及细胞毒性反应：而高分子量聚合物可降低其生物降解率，虽不能消除上述不良反应，但可以将其延迟或减弱⋯’”。⋯。通过水解的方式PLA降解产生乳酸可直接参加三羧酸循环，PGA降解产生的乙醇酸随局部血液循环经尿排出体外，宿主单核细胞、多形核白细胞也担负局部降解产物的消除工作。体内实验观察PLA／PGA共聚物(DL—lactide—CO—glycolide)植入大鼠肌袋内，28—35天没有发现淋巴细胞／浆细胞的局部浸润，表明它有良好生物相容性““，这类高分子材料在国外已商品化生产，但国内还处研制阶段，特别是材料孔隙的制作工艺尚有待进一步改进。为了解决可吸收高分子聚合物普遍存在的力学强度低、韧性差的问题，许多学者“2’”1研究了高分子材料的自增强(Self-reinforced)复合技术，即用可吸收性聚合物树脂制备成纤维去增强同一树脂基体。如PGA和PGA／PLLA的自增强复合材料，这种自增强材料具有良好的韧性和初始机械强度“”。(3)生物陶瓷类。从对人体骨修复植入材料的要求性能来看，生物陶瓷材料除其力学性能外是较优良的植入材料。生物陶瓷材料分为生物惰性陶瓷材料和生物活性陶瓷材料两大类。生物惰性陶瓷材料化学性能稳定，引起有害的生物反应少。以羟基磷灰石(HA)为代表的磷酸盐生物活性陶瓷，不但不产生排异反应，由于其化学组成近似于骨矿物质，机械强度较高，具有优异的骨传导性，含有能通过人体正常代谢途径可转换的元素，如Ca、P及能与人体组织发生键合6 四川大学博士学位论文的羟基(OH一)基团，植入人体后，其表面同人体可通过键的结合，达到完全亲和w。HA易于吸附BMP又可使之赋于骨诱导性，虽然有脆性较大，其纯品不易于降解等缺点⋯3，但还是在骨科领域得到广泛的应用“”。0一磷酸三钙(0一TCP)是一类可降解的生物陶瓷，具有良好的生物相容性、骨传导性，材料表面的降解产物可使局部Ca和Pi(指全部游离的无机磷酸根离子，如HP04’、H2P0。一、PO^)浓度升高有利于钙化组织的形成，也是较为理想的组织工程材料“”⋯，它的缺点是质脆易碎。抗撞击能力较差，使它的应用受到一定限制““”1。目前国外及国内都有多孔HA，B-TCP成品出售。(4)磷酸钙骨水泥(CalciumPhosphateBoneCement，CPBC)可在生理条件下等温自固化，可在术中现场塑形，与骨缺损高度整合、紧密接触，植入后很快达到稳定的物理结合；固化后形成稳定的、具有微孔结构的磷酸钙化合物，具有良好的转导性成骨作用，而且可在体内缓慢降解吸收并转化为新骨。但由于CPBC只具有传导性成骨作用、无诱导成骨作用，从而使其中一部分材料有可能被软组织代替两降低强度。目前的研究表明，将具有传导和／或转导性成骨作用的材料与具有诱导成骨活性的骨生长因子结合可明显增加成骨量。如Ohura将CPBC固化体复合骨形态发生蛋白(BoneMorphogeneticprotein，BMP)发现新骨生成量明显增多，骨缺损被完全修复。值得提出的是生物活性材料本身的骨诱导活性这一概念。OhgushiH等的实验证明磷灰石一硅灰石玻璃陶瓷(apatite—wallastonite—containingceramic，Awceramic)有诱导骨髓基质细胞向成骨细胞方向分化的能力并且这种能力受表面粗糙发的影响。他们在实验中又发现磷灰石(apatite，hp)沉积在(在体液的生理环境下或体外模拟体内生理环境下这种沉积均可自然发生)Aw后形成的Ap／AW复合材料使这种诱导能力大大地加强了。因此他们推断一些生物活性材料有促使在它们表面的骨髓基质细胞分化为成骨细胞的作用“”。为此，HenchLL噼1提出了骨产生(Osteoproduction)的概念，其意义是活性材料表面有刺激并加速祖细胞的成骨细胞方向分化并增强其成骨能力的作用。Vrouwenvelder等嘲和Keeting等阻1的实验支持这一观点。生物活性材料的这一特点对于骨组织工程来说有重大意义，但其诱导作用与BMP的作用对照研究以及两者是否有协同作用的研究有待进一步进行。亦有实验结果与上理论相悖，NeoM等从不同角度的多种研究证明B—TCP没有此种作用“”。但若将TCP磁化 旦=茎型!壁墼塑墨堑型量堡壅墨盒塑型箜笙至——一一后形成磁性的TCP有较强的促进新骨形成的作用”1。由纳米数量级极细晶粒组成的固体材料一纳米材料，是现代材料科学研究的重大进展之一。对于骨组织工程来说，纳米陶瓷材料(Nanoceramics)的研究进展，有希望降低普通陶瓷的脆性，增加其塑性和韧性效果，也可改变TCP材料的降解速度“”。有机硅材料可能成为下世纪最好的骨组织工程的信号分子载体之一。1．2．2．2通过表面修饰技术改变生物材料的表面特性，增加其生物相客性细胞在载体表面的贴附生长是其发挥功能的前提条件⋯3。改变载体表面形状(shapeandconformation)、粗糙程度(roughness)、化学成份(chemistry)和表面能量(surfaceenergy)，以提高其生物相容性，是组织工程研究的主要方向之一”1。RogersKR等㈨和DalasE等”“应用表面修饰工艺把高分子材料表面磷酸化，使其在生理条件下HA易于沉积于聚合物表面，并且其晶体曲向性增长(epitaxialgrowth)，以增强材料的机械强度，改变其降解速度。在载体表面复合胶原“2‘139]透明质酸“⋯、氨基酸多肽链[如含有一精氨酸一谷氨酸一天冬氨酸一(一RGD～)等15个氨基酸多肽链]”⋯、血清中的细胞外连接素(vitronectin)“”、海藻“”等基质可以促进细胞的贴附。伸展和增殖：在Aw表面涂上磷灰石涂层可使载体增强诱导活性““。此外，人们正在探索用胶原、明胶海绵““1、纤维蛋白凝块“”3等与生长因子复合作为生物载体释放系统涂于载体材料表面以维持生长因子的持久作用。将作为生物材料的天然生物组织经过特殊处理，使之转化为生物衍生材料以提高其性能也是骨组织工程载体制备技术的发展方向之一””。1．2．2，3设计材料支架的最佳超结构，改善复合细胞的营养环境1995年WintermantelE等“71提出材料的超结构工程学(superstructureengineering)的概念，它是载体支架的构筑艺术(scaffoldarchitecture)。把用于组织工程的可降解或不可降解材料，经特殊工艺和技术处理，做成纤维交织、膜样重叠、带有特殊孔隙的与机体原组织相适应三维支架结构，给载体内组织细胞提供最佳营养弥散渗透条件、生长空间环境和力学支架结构。材料基体的超结构成形技术在骨组织工程方面有很多潜在的应用价值。窟 四川大学博上学位论文早在1971年Klawitter和Hulbert“1就已证明适合骨组织长入载体的最小孔隙至少应是100um，载体的适宜孔径应是100～500t．1m。用不同编织方法可以将材料纤维编织成所需的孔隙形状和孔径尺寸的三维编织载体，编织方法本身就可以控制编织载体的强度和韧性，若再将材料部分或全部浸渍于或充满高分子可降解基质中，其强度和韧性可进一步增强。”””。用上述方法制成的碳纤维网状结构材料早已是皮肤组织工程的良好载体，这种载体形状的可控性，在骨组织工程和软骨组织工程中可用于研究不同形状的表面对成骨细胞和成软骨细胞功能的影响‘”1。用液体注射的方法将浸入其内的材料纤维细丝带入机体内，液体将局部组织扩张，纤维细丝则自动缠绕，网织成团，填充缺损而形成载体，若将硬材料微粒附着于柔软的纤维丝上就可以赋于载体一定的抗压强度““。再将高密度体外增殖的成骨细胞注入载体，即工程细胞的体外增殖，体内组装，使之发挥成骨效应，就为骨组织工程植入载体时减少手术带来的医源性损伤提供一条途径。血管极性(angiopolar)载体具有特殊结构”。7“，它由大孔(约lmm)与中孔(30～50pm)和微孔(2um)两个孔隙系统构成，大孔诱导血管定向发生，即大血管出入载体的通路，出入载体的大血管再发生毛细血管布满载体的中孔营养孔内细胞，微孔传递营养物质。WintermantelE等将氧化铝作成此类载体，发现载体内的血管构筑似肝小叶的血管呈树枝样分布，使载体内获良好的血液循环，植入载体的NIH3T3细胞生长良好”1。但氧化铝是一种隋性的非降解材料，值得借鉴的是此类载体的血管极结构对血管在载体内再生模式的影响。若将生物活性载体(HA或B—TCP)制成此类结构，对于改善载体的血管构筑和血液循环有一定作用。总之，无论体外还是体内组装的骨组织工程细胞复合体都应是一个开放系统(opensystem)，以利于细胞复合体和机体组织之间的桥接融合。在这个融合过程中，载体周围的毛细血管和问叶组织均不可避免地长入其内，因此可提出骨组织工程双重诱导的概念，即复合在载体上的信号分子有诱导工程细胞和体内未分化的间充质细胞的双重作用，使细胞复合体发挥更好的成骨效能。从上述综述可见合适的载体可为成骨细胞提供生存空间、营养物质及代谢产物交换的场所和成骨的必要条件，并克服骨缺损局部的不同组织结构和病理变化对成骨细胞功能的影响。因此，应用合适的载体是骨组织工程成败的关键因素之9 生苎型!壁墼壁墨要呈量堡墨墨鱼翌型箜堡茎一——1。2．3用于骨组织工程的诱导因子和生长因子对于刺激细胞产生成骨效应的作用，过邦辅认为可以分为两种，其一是对于本无成骨能力的细胞经刺激后转化为成骨细胞，这一作用称为诱导(induction)，而把具有这一作用的因素或物质称为诱导体；其二是刺激成骨细胞使之功能活跃，成骨作用加强，这一过程称为调节(modulation)””。在机体骨形成和骨愈合过程中，诱导和调节均发挥作用，只是作用的主次和时间有所不同，不能将其独立地分割开来。目前已知的诱导体主要有：(1)因子：BMPs等；(2)细胞：尿道移行上皮细胞；(3)基质物质：姗。Ap／Aw等。地塞米松(Dex)虽然没有异位诱导成骨作用，但它可在体外状态下明显提高骨髓基质细胞的碱性磷酸酶活性(ALP)，经过Dex处理的骨髓基质细胞植入体内后其成骨活性明显增强，故虽然国际上尚没有把Dex定为骨诱导物质，但其确有一定的骨诱导作用。目前已知的参与或影响骨形成、骨愈合、骨代谢的激素和因子有数十神之多(见表1．2)。衰I．2参与或影响骨形成、骨愈合、骨代谢的激素和因子Tabla1．2Hormonesendfactorsofaffectingorparticipatinginprocessofosteogenesis，osteorestitutionendosteometaboIiSm作用激素和因子促进骨形成降钙素(研)、性激素(雄激素、雌激素)、生长激素(Gtt)胰岛索(IH)、维生素D、前列腺素Ez(PGE：)骨形态发生蛋白(BMPs)、酸性和碱性成纤维细胞生长因子(8、bFGF)、胰岛紊样生长因子(IGF)、v干扰索(INF—Y)等。促进骨吸收甲状旁腺索(PTH)、甲状腺鬟(T。)、三碘甲状腺原氨酸(T。)、糖皮质激素(Hc)、白细胞介素1、3、6(LI¨c)、肿瘤坏死因子(TNF)、集落刺激因子(GSF)等。具有骨形成转化生长囡T-e(TGF—B)、表皮生长因子(EGF)、血板源性和骨吸收双生长因子(PDGF)等。重作用IO 列川1人学博士学位论文骨形态发生蛋白(Bonemorphogeneticprotein，8MP)是存在于人和动物骨、牙齿等组织中的一种蛋白质，能够异位诱导间充质细胞分化为软骨和骨细胞”“。1987年Urist”“建立了一套从人和牛骨中提取BMP的标准步骤。至今在鼠、兔、马、牛、羊、犬、猪、猴多种动物及人的骨、牙齿、骨肉瘤中都分离和得到了BMP”””1并对不同种属间的BMP结构、性质进行了比较研究，发现不同种属问B帅具有高度同源性⋯’“。通过利用纯化的BMP和适宜的载体结合进行骨缺损与骨不连的修复已取得了成功07’”1，为临床上骨缺损修复开辟了一条新途径。但由于BMP在骨内含量极微，从骨组织中提取天然BMP方法繁杂，收获量低，重复性差，纯化十分困难⋯1，难以满足临床的需求。随着基因工程技术的发展，出现了重组人骨形态发生蛋白(recombinanthumanbonemorphogeneticprotein，rhBMP)，它以产量高、纯度高、活性好且稳定、质量易控制而明显优于天然BMP，给临床上广泛应用BMP进行骨缺损修复带来了美好的前景。在rhBMP的研究中以rhBMP一2最为活跃。此外还发现了多种源于骨及软骨并特异地作用于这些组织的生长因子，有骨源性生长因子(BDGF)、骨生长因子(SGF)、软骨诱导因子(CIF)等。随着对骨诱导和影响骨代谢调控因素研究的不断深入，人们已经认识到机体完成骨形成与骨吸收的协调平衡是局部与全身生长因子以及激素构成的网络系统精确作用的结果。⋯，而对这个网络系统的形成和作用机制的研究也有助于探索促进骨组织工程的工程细胞发挥最大的成骨效应的有效方法提供途径，是骨组织工程的研究方向之一。对于单一或多种因子的生物缓释载体系统的研究是骨组织工程研究的另一个方向，它不仅要求复合因子的缓慢释放，使局部长时间保持因子的有效浓度，而且也要求多种复合因子的不同时间释放，以达到最佳的成骨效应9“。用基因转染技术，将BMPs的基因转染工程细胞，增加内源性BMP的稳定表达，是一条崭新的思路眦‘”1，目前尚处于研究阶段，它的优点是省去了载体上制备因子缓释系统的工艺过程，转染的工程细胞BMP的稳定表达可起到双重诱导作用，因此转基因工程细胞有着广阔的应用前景。 塑盔型!壁堕塑墨堑里量堡墨墨鱼塑型塑竺垄一——1．2．4骨组织工程的工程细胞工程细胞是组织工程的主体，骨组织工程的工程细胞是成骨细胞，它的数量及功能状态是影响细胞复合体成骨效果优劣的主要因素之一。机体内功能活跃的成骨细胞见于生长期的骨组织，它们多聚集在新生骨质表面9“。骨髓及骨膜内尚存在静止的成骨细胞，数量不多，是机体应付应急状态(如骨折)的储备细胞⋯-⋯。机体内有多种细胞可以转化为成骨细胞或发挥成骨效应，它们均由来自于中胚层组织的间充质细胞分化而来。”，已有报道的此类细胞及所在部位如下。1．骨外膜骨生成细胞，骨内膜骨生成细胞(包括在哈佛氏系统及福尔克曼氏管内的内膜细胞)。2．未分化的间充质细胞，主要分布于血管周围的结缔组织内。3．成纤维细胞主要是位于骨髓，皮肤及固有结缔组织中的成纤维细胞。4．骨髓基质细胞5．骨细胞16．血管周细胞及内皮细胞7．滑膜细胞8．成肌细胞就现有资料来看，对上述有关细胞做必要的分析，以确定用于骨组织工程的成骨细胞来源。1．2．4．1来源于骨外膜的成骨细胞Squier等”1和Feik等汹’根据骨外膜内细胞、纤维和基质的比例关系提出骨外膜的三层分法，即第一层为成骨细胞上层(supra—osteoblastlayer)，由紧邻骨表面的成骨细胞及其浅面的成纤维细胞样细胞(骨祖细胞)构成，第二层是相对透明区，毛细血管丰富，主要细胞成份为血管内皮细胞，巨噬细胞及未分化的间充质细胞，后者能为第一层和第三层提供祖细胞，第三层由胶原纤维和大量成纤维细胞构成。从骨骼发育的角度来看，无论是膜内成骨还是软骨内成骨形成的骨组织，位于其骨膜第一层的成骨细胞及骨祖细胞是参与其形成和改建的执行者，故无论它们处于活动期还是静止期它们均属于确定性骨祖细胞(DOPC)。在胚胎期和出生后的成长期内，它们由多层细胞组成而且成骨功能 四川大学罅上学位论文活跃，成年期后骨的生长停止，在骨的改建部位以外的成骨细胞处于静止阶段．骨祖细胞相对较少，不再排列成层。由此可见骨膜中存在未分化的间充质细胞、骨祖细胞、成骨细胞三个不同分化阶段(hierarchy)的细胞群体，这种阶梯式的细胞群体是骨膜具有巨大成骨潜能及作用的生物学基础。动物实验证实骨膜成骨细胞在游离骨膜移植”’”’及带血循的骨膜移植““’”1中的成骨作用，不次于甚至大于自体骨移植。已有报道在体外培养条件下骨膜成骨细胞表现出明显的成骨特征“”’“1，而且取传代骨膜成骨细胞无需经诱导体的作用进行裸鼠皮下注射以及与多孔磷酸钙陶瓷复合后植入裸鼠体内(背部)，均有大量骨与软骨形成””’，表明骨膜成骨细胞可以作为骨组织工程应用的高效成骨细胞来源，但是除非对于创伤患者可术中取材外，获取骨膜成骨细胞尚需手术取材而限制此类成骨细胞的研究与利用。1．2．4．2骨髓的结构与骨髓戍骨细胞(1)骨髓的结构骨髓是充满在骨髓腔内和骨小梁之闭的组织。它由血管神经、网状组织和基质组成的骨髓基质系统和其间充满的实质细胞(骨髓造血系统)两部分构成。在骨髓的基质系统中，由一个或多个相互伴行的中央动脉、静脉以及血窦组成血管系统。中央动脉呈放射状发出许多动脉分支，～部分进入骨组织营养骨，另一部分与血窦相连，静脉血经血窦回流到中央静脉，并从远心端向近心端流出骨组织。血窦是骨髓血管系统中的突出结构，它大小不等，形状不规则，呈网状密布于骨髓腔；它腔大壁薄，腔的容积随血液的充盈状态而变化，血窦壁由连续的内皮细胞和不连续的外膜组成。其间有一层不连续的基底膜。血窦是骨髓血细胞和血液循环之间的～道屏障，即骨髓一血屏障，它有利于血细胞，生长因子及营养物质通过，以支持骨髓细胞的生长代谢。造血细胞索位于血管网系统外侧条状间隙内，主要由巨噬细胞(包括窦周巨噬细胞和中央巨噬细胞两种)、造血千细胞及处于不同分化阶段的血细胞组成⋯1。骨髓基质的细胞成份，即骨髓基质细胞(marrowstromalcells，MSC)，包括成纤维细胞、网状细胞、脂肪细胞、成骨细胞等。以往还包括巨噬细胞和内皮细胞，但近年来发现两者均有独立的祖细胞(分别归属于造血系统和内皮细胞系统)，因此常将其排除在基质细胞之外“”’I“1]o近年来愈来愈多的证据表明，与造血系统的分化过程类似，基质系统中的细胞系由基质干细胞(Marrow13 周人利：磷酸钙系新型骨修复复合材料的研究一stromalstemcells，mSSC)分化而来““。”3，Owen等“删报道随着这种分化程度的增高，细胞的自我更新和多方面分化能力降低，分化过程如图1．1。成纤维细胞多能干细胞—’定向干细胞网状细胞——CFU—F——脂肪细胞成骨细胞图1．1NSSC分化过程Fig．1．1ProoossofMSSCdifforentiatiON在体外培养条件下，多能干细胞和定向干细胞可贴壁生长形成克隆，因此将这两类细胞称为成纤细胞集落形成单位(细胞)(colonyformingunit—fibroblastic，CFU—F)。目前CFU—F在骨髓中的形态特点，确切位置及与其他骨髓细胞的关系尚有待于进一步研究“”1。组成血窦外膜的成纤维细胞呈分枝状，它分泌的网状纤维和由伸入造血细胞索内的内皮细胞胞浆突起与网状细胞共同构成了支持血细胞的三维网状支架，脂肪细胞、成骨细胞散在其间，但前者主要分布在骨髓的中央部分，而后者则主要分布在近骨的周边部分。”。成骨细胞常成堆出现，其边界不清，偶见单个存在哺1。有研究表明与造血干细胞分布类似骨髓基质干细胞也主要分布在骨髓用边部分的基质内“⋯1。基覆系统形成的网状结构不仅给造血系统提供了立体结构支架和生存空间，防止骨髓塌陷，而且其细胞间作用以及释放的生物活性因子(如粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子“”1等)活化，诱导和调节造血干细胞的增殖、分化和发育，即形成血细胞发生的“诱导微环境”(hemopoieticinductivemicroenvironment，HIM)[鲥．1zs]o(2)骨髓成骨细胞研究证明骨髓的成骨作用是由于骨髓中存在由骨髓基质干细胞分化而来的处于不同分化阶段的骨髓成骨细胞的缘故““”⋯。骨髓基质干细胞(marrowstromalstemcells，MSSC)是机体内未分化的间充质细胞的一部分，使之发生向成骨细胞方向分化的始动因素尚未明了，推测骨髓内环境的影响而启动分化过程。将兔或鼠的骨髓注入扩散盒(diffusionchamber)或肾脂肪囊中，并将扩散盒植入自体腹腔或肌肉中不加入任何诱导因素，8周后扩散盒中自发的有软骨和骨组织形成“”‘““““⋯，因此骨髓内存在确定性骨祖细 四门1大学博上学位论文胞(DoPc)(即无需诱导可直接分化为成骨细胞)，Friedenstein称之为基质成骨祖细胞(stromalosteogenicprecursorcells)“”3。有的学者认为骨髓中仅存在DOPC，但Owen认为“”1MSSC即为诱导性成骨祖细胞(IOPC)(即需经诱导因子作用才能分化为成骨细胞)，此外有证据证明骨髓内的网状细胞和成纤维细胞在特定环境下(如经BMP作用或骨折)可以转化为成骨细胞而发挥成骨作用“”’“⋯，它们也应属于IOPC，可见骨髓是同时存在DOPC和IOPC两类细胞的组织。在体外状态下骨髓细胞混合多克隆培养形成的CFU-F的数量反映骨髓内MSSC和定向祖细胞的数量，检测高表达ALP的CFU—F的数量可以间接确定骨髓中DOPC的数量，Owen等“”1的实验资料显示成骨性的CFU—F数量(高ALP表达)仅占CFU—F总数的2．5％，可见在骨髓内的特定环境下DOPC的数是很少的，但确保持一定数量，即存在着IOPC和DOPC不断分化的动态过程。在成年骨髓中DOPC是处于幼稚状态或静止状态，并不发生成骨效应(骨改建过程除外)，但是当骨髓的内环境造到破坏时如被抽取““1，经一定量的射线照射““1，骨折发生时““’⋯骨髓DOPc功能活跃，成骨能力增强，这种情况不仅发生于局部而且也发生在全身，甚至在急性失血时骨髓内的CFU—F的数量也将增加““1。骨髓成骨细胞成骨能力的检测是用它在扩散盒中的异位骨形成来确定的““1。在体外状态下，MSC大量增殖后，定量植入扩散盒内观察，其成骨能力亦成比例地增加，即传不同代数一定数量的MSC成骨能力基本一致，表明骨髓成骨细胞在体外状态下不仅可大量增殖而且其成骨活性不变。但在实际上，由于DOPC数量很小，在骨折愈合过程中，由于内源性BMP的诱导作用，使IOPC分化为成骨细胞而发挥主要的成骨作用。由此可见与骨膜组织相似，骨髓中也存在着MSSC、定向骨祖细胞、成骨细胞三个不同分化阶段的细胞群体，在骨形成、骨愈合、骨改建过程中显示了巨大的成骨潜能。1．2．4．3骨细胞骨细胞是骨原细胞经成骨细胞阶段后分化发育的终末阶段，成骨细胞被其自身分泌的类骨质钙化后埋藏于骨陷窝内转化为骨细胞，其突起借骨小管与周围的骨细胞突起相连。成熟的骨细胞不能增殖，也不移动m1。它在功能上具有双重性，即在甲状旁腺激素(PTH)的作用下引起骨陷窝周围骨的骨细胞性骨溶解，使骨陷窝腔隙增大，窝壁粗糙不平；而在降钙素(CT)的作用下又可诱发1E 岗大利：磷酸钙系新型骨修复复合材料的研究骨陷窝内骨细胞性骨形成，使骨陷窝壁增添新的钙化骨质。骨细胞的双重作用对维持骨基质的稳定和调节血钙浓度起到了重要作用”“。在骨折发生后，骨折端表层骨质由于缺血而发生坏死，既使有部分骨细胞裸露，其数量也极为有限。故在骨折愈过程中骨细胞的作用甚微。但研究证明将骨粒(约lmm3)经胶原酶处理后骨细胞释放出来可转化为成骨细胞，不仅能够大量增殖而且还表现出较强的成骨能力“4““。作为骨细胞的特例，乳鼠颅骨骨细胞是一种标准的成骨细胞“”1”1，用它建立起来的成骨细胞系MC3T3-E1已在世界范围内广泛地被应用“““3。因此骨细胞可以作为成骨细胞来源进行体外研究。但在实际上不能取材，将骨细胞为骨组织工程的工程细胞是无意义的。1．2．4．4成纤维细胞它不仅是疏松结缔组织的常见细胞，而且也大量地存在于致密结缔组织中。成纤维细胞也具有成骨潜能“⋯，柴本甫报道在骨折愈合过程中骨髓内及骨折端周围软组织中成纤维细胞不仅参与纤维骨痂的形成，而且随着纤维骨痂演进转变为骨性骨痂后，最终演变为骨细胞““1301。又有实验证明体外培养条件下皮肤或纤维细胞有较强的ALP表达，并形成钙化结节，表明皮肤成纤维细胞亦有一定的成骨能力“3。⋯。但是成纤维细胞与各种成骨细胞成骨能力的比较研究，以及各种骨诱导因子，特别是BMPs对成纤维细胞成骨能力的影响尚有待进一步研究。若把它作为骨组织工程的工程细胞尚存在来源问题，因为取材将造成新的损伤，因此只能认为成纤维细胞在骨组织工程方面具有潜在的应用价值。1．2．4．5骨内膜细胞骨内膜被覆于骨干和骨骺骨髓腔以及所有骨单位(包括哈佛氏管和福尔克曼氏管)的内表面，并且相互连续，主要由一层扁平的细胞组成嘲1。骨内膜细胞也是具有成骨潜能的骨原细胞，柴本甫等⋯”报道内骨膜细胞在骨折愈合过程中以形成封闭骨痂和桥梁骨痂为主。尽管如此现有技术尚无法得到纯净的骨内膜细胞，骨内膜细胞不能作为骨组织工程的工程细胞。1．2．4．6未分化的间充质细胞成体的结缔组织内仍保留未分化的，有着胚胎时期间充质细胞朝多方向分16 凹川大学博：七学位论文化潜能的原始细胞，即未分化的间充质细胞，它主要分布在小血管周围，尤其是毛细血管周围。它属于IOPC，在诱导因子作用下可分化为成骨细胞、成软骨细胞而发挥成骨作用，是参与体内组装的骨组织工程载体的主要细胞之一，在细胞形态上它与成纤维细胞类似，不易鉴别，更不能将其分离，不作为用于体外增殖诱导的骨组织工程的工程细胞。此外有报道内皮细胞和毛细胞血管后小静脉的周细胞“”’⋯、关节滑膜细胞“⋯、成肌细胞“⋯也具有成骨潜能，但实际上这些细胞无法分离也不能作为骨组织工程的工程细胞。综上所述，对于体外组装的骨组织工程的细胞复合体来讲，将其复合大量高效纯净成骨细胞是其发挥成骨作用的可靠保证。从以上分析的结果来看，成骨能力较强的细胞依次是：(1)在性质上，确定性骨祖细胞(DOPc)>诱导性骨祖细胞(IOPC)：(2)在部位上，骨膜成骨细胞=骨细胞>骨髓基质细胞>骨内膜细胞>成纤维细胞>其它部位细胞。结合取材的方便性和减少医源性付损伤的原则，可供选择的工程细胞仅有骨膜成骨细胞和骨髓成骨细胞。骨髓组织可以通过骨髓穿刺抽取的方法得到，操作简单、安全，经过体外增殖，诱导可以得到大量的骨髓基质细胞，因此骨髓基质细胞是骨组织工程首选的工程细胞；骨膜成骨细胞成骨能力较强，但需手术取材限制了它的使用；骨细胞仅可通过动物实验用做骨组织工程方面的应用研究；成纤维细胞的成骨能力及提高其成骨能力的方法尚处于观察研究阶段；其余具有成骨替能的细胞均不作为骨组织工程的工程细胞使用，但它们可在体内参与骨组织工程细胞复合体的成骨作用(即体内组装)。1．3本章结论随着组织工程学学科的兴起，最终解决由于组织或器官缺失或功能衰竭而威胁病人健康甚至生命这一难题已为时不远。构成组织工程学的三个基本要素为生物组织的基体材料、具有特定功能的组织细胞及调节细胞增殖分化的细胞因子。在骨科领域，为了达到最佳的成骨效果，骨组织工程学用于作为载体的材料方面的研究主要集中在以下三个方面：(I)探索具有良好生物相容性可降解的生物材料；(2)通过表面修饰技术改变生物材料的表面特性，增加其生物相容性；17 周人利：磷酸钙系新型骨修复复合材料的研究(3)设计材料支架的最佳超结构，改善复合细胞的营养环境；理想的骨组织工程载体应具有以下特点：(1)材料本身无毒性，是工程细胞(即成骨细胞)贴附生长，增殖分化的适宜底物，并有一定的力学强度，为工程细胞发挥功能(成骨作用)提供支架(骨传导作用)；(2)也可作为信号分子载体释放系统调节工程细胞的功能(包括信号分子的骨诱导作用)；(3)能降解，降解产物无毒性，不蓄积，不致癌，降解速度和载体内成骨速度相适应，以使新生骨组织在组织学和力学上最终取代载体；(4)有利于新生毛细血管的长入，适合营养物质，代谢产物及载体降解物质的分散吸收。在高分子材料类中，作为支架材料的聚乳酸通过水解降解产生乳酸可直接参加三羧酸循环，并具有良好生物相容性。在生物陶瓷类中，B一磷酸三钙是一类可降解的生物陶瓷，具有良好的生物相容性、骨传导性，材料表面的降解产物可使局部Ca和Pi(指全部游离的无机磷酸根离子，如HP04’、H2P04一、P04”。)浓度升高有利于钙化组织的形成，是较为理想的组织工程材料。B一磷酸三钙能制备成致密陶瓷或多孔支架材料，与生物活性分子组成生物活性骨修复复合材料，也既是骨组织工程修复材料．a一磷酸钙骨水泥可在生理条件下等温自固化，可在术中现场塑形，与骨缺损高度整合、紧密接触，植入后很快达到稳定的物理结合；固化后形成稳定的、具有微孔结构的磷酸钙化合物，具有良好的传导性成骨作用，而且可在体内缓慢降解吸收并转化为新骨。将预先成型的磷酸钙骨水泥与具有诱导成骨活性的骨生长因子结合组成新型生物活性骨修复复合材料，可明显增加成骨量。1．4本研究工作的设想在文献综述基础上，本研究拟进行新型骨修复复合材料(骨组织工程材料)的制备、理化性能及生物学性能的研究。为比较效果，拟进行以下几种体系材料制备及性能的研究：(1)BMP／Ⅱ一磷酸钙骨水泥生物复合材料；(2)rhBMP一2／B—TCP人工骨材料；lR ～．幽型叁兰堕!兰堡笙塞(3)0一TCP／兔骨髓基质细胞人工骨材料；(4)PLLA／13—TCP与大鼠骨髓基质干细胞及PLLA／13—TcP和大鼠骨膜成骨细胞复合的人工骨修复材料；具体研究内容为：1．磷酸钙系原料制备磷酸钙系原料制备包括制备过程热力学研究及动力学研究：高性能n一磷酸钙骨水泥粉料、t3一磷酸钙粉料及B一磷酸钙多孔支架材料制备研究。2．BNP／n一磷酸钙骨水泥生物复合材料制备研究以1岁以内小牛长管状皮质骨作为原料提取BMP研究。通过优化n一磷酸钙骨水泥的物理性能，在d一磷酸钙骨水泥固化之前将BMP复合其中制备出BMP／a一磷酸钙骨水泥复合材料，体内外实验分别观察BMP／a一磷酸钙骨水泥复合材料的成骨作用和BMP释放规律，最后用兔颅骨缺损修复实验来评价其成骨和修复缺损的效果，以期研制出～种可以临时塑形的、兼具转导和诱导成骨作用的、可被降解吸收并最终被自体新生骨所取代的生物活性颅骨成形材料，为最终的临床应用提供实验及理论根据。3．多孔rhBMP-2／13-TOP人工骨的诱导成骨和降解行为一小鼠体内的研究本实验将6一TCP／rhBMP一2复合物植入小鼠大腿肌肉内，观察该复合物的骨诱导性和降解行为，为将来的实验和临床研究提供依据。4．兔骨髓基质细胞在可降解多孔B—TOP载体上的细胞学行为研究兔骨髓基质细胞在可降解多孔13～TCP载体上的细胞学行为。5．B—TcP／PLLA与大鼠骨髓基质千细胞及B—TcP／PLL^与大鼠骨膜成骨细胞复合的人工骨修复材料的研制本实验进行口一TcP／PLLA多孔支架材料制备研究及其性能研究，将骨膜成骨细胞和经成骨诱导的骨髓基质于细胞作为种子细胞种植PLLA／JB—TCP多孔复合材料上，研究支架材料和种子细胞对组织工程复合材料性能的影响。19 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四川大学博L学位论文differentiationofmarrowCFU～F．JCellSci1987．87：73l一738．148．LippielloL．ChavdaD，ConnollyJ．Colony—formingefficiencyresponseofbonemarrowstromalcellstoacutebloodloss．JOrthopRes，1992，lO：145—148．31 型查型!堕墼塑墨堑型量堡塞堡全塑整堕型壅一第二章磷酸钙系原料制备及性能研究八十年代以来，人们对生物降解(biodegration)型磷酸钙陶瓷材料给予了极大的重视并进行了较深入的研究。具有良好生物相容性、骨传导作用和生物降解性的B—TCP特别引人注目，同时可在术中临时塑形的CI—TCP骨水泥已得到充分重视“1“。它们的组成成分与生物骨中的无机成分相似，生物相容性好，植入体内后发生溶解，溶解下来的ca、P进入活体循环系统然后形成新生骨，一定时间后非生命的植入体逐渐溶解消失，为有生命的新生骨所取代。在成骨速度上B—TCP优于羟基磷灰石(HA)，是一种非常理想的、临床应用前景十分诱人的硬组织缺损修复材料。致密型陶瓷表面仅有微孔或光滑无孔，除力学性能较多孔型为好外，不利于骨组织和血管长入。多孔型结构类似于松质骨，利于骨和血管长入。Klawitter“”认为骨组织长入人工材料最小孔径为lOOum，150um为理想孔径。但Flatly“41认为孔径500um为合适。因此，目前制作的多孔钙磷陶瓷孔径在100～500um之间。孔径(5um称微孔。致密型仅有微孔。多孔型既有微孔也有大孔(100～500um)。大孔利于骨组织长入。微孔能使材料与组织和组织液接触面积增加，有利于生物降解。近年来，许多学者对多孔生物活性陶瓷进行了大量研究，使所研制的材料类似骨的结构，有利于组织长入和骨再生“‘”’。概括起来，多孔材料有一下优点“”：(1)比致密型材料易塑形，重量轻：(2)能为新生骨组织长入材料提供通道和场所：(3)多孔结构增大了材料与受植区组织血管和界面的接触，有利于加速界面结合的反应过程，并为携载骨诱导物质(如BMP和骨髓组织)提供空间(4)内部孔隙通道有利于长入材料的血管彼此连通，以傈证长入材料深部的组织有营养供给：(5)多孔结构使机体骨组织长入形成机械性锁结(interlocking)，增强彼此的结合。此外，多孔材料还有一潜在优点““，当组织逐渐长入孔隙后形成种植体／骨组织复合体，可以显著改善材料的力学性能。用普通方法制备台勺8一TCP多孔生物陶瓷，若溶解速度较快则强度较低，若降低空隙率提高强度，则负载骨形态发生蛋白(BMP)或骨髓基质于细胞(MSCs)的能力差和溶解速度低。另外生成的孔在宏观上大部分为封闭孔，也影响蹦P或MSCs的吸载和释放。32 四川大学博士学位论文材料的性能不仅与其化学组成和结构有关，而且在很大程度上与其表面界面性质(如位错、表面能、比表面积等)有关，而晶粒的大小决定了材料的表面性能，尽量减小晶粒度是获得高性能材料的主要途径，因而研究超细粉体的制备技术已成为材料领域的热门课题，也是国内外在材料研究中的发展趋势。制备具有合适孔结构和足够力学强度的PLLA／13一TcP复合材料支架需要超细、均质、单分散性好、表面活性高的13一磷酸钙陶瓷粉末。张昭⋯用高纯碳酸钙作为原料。采用包裹沉淀法制备n—TCP，详细研究了各种磷酸钙化合物、CaO及CaCO。调配成Ca／P比不同的磷酸钙骨水泥配方的凝结时间和抗压强度，指出作为a—TCP类磷酸钙骨水泥主成分的a—TCP有很好的水化自凝作用，其水化产物有很高的抗压强度，骨水泥的抗压强度与口一TCP的含量有密切关系，改善磷酸钙骨水泥性能的根本途径是制备优良性能的a-TCP粉料。目前国内外研究的磷酸钙水泥基本上都是由几种磷酸盐组成，其中研究较多的是以磷酸四钙(TTCP)分别与二水磷酸氢钙(DCPD)及无水磷酸氢钙(DCPA)为主的两个体系。本研究选用a一磷酸三钙(a—TCP)为基本原料具有以下优点：Ca／P比适中，可根据需要添加其它原料配制不同的cP骨水泥基料；植入体用生物活性磷酸钙陶瓷(CPC)材料，要求有害元素含量尽可能少。要制备高性能的Ⅱ-TCP、B—TcP及多孔13—TcP支架材料，首先要制备高性能的TCP前驱体，TCP前驱体性能与制备CPC粉末的原料粉末粒度密切相关，目前许多研究者在制备磷酸钙类化合物时都是采用化学试剂作为原料，因而很难保证工艺对原料试剂纯度和粒度的要求。本研究采用自制高纯微细碳酸钙微粉为原料，保证了产物对碳酸钙粉末的纯度和粒度要求。为此，本章将致力于以下几个方面的研究工作：1．通过热力学计算，对各步工艺制各条件进行指导。2．以高纯碳酸钙微粉作钙的起始原料，采用不同的加料顺序，建立制备高品质磷酸三钙前驱物的新工艺。3．研究不同煅烧工艺条件对超细d—TCP、B—百CP粉料粒度的影响4．通过工艺条件研究，制备出力学性能和降解性能优良，降解速率可控的e—TCP多孔生物陶瓷，为骨修复复合材料的制备做前期准备。 周大利：磷酸钙系新型骨修复复台材料的研究2．1热力学分析磷酸钙化合物是磷酸钙系陶瓷及骨水泥的基本原料，其制备方法可分为干法和湿法两大类。下面对湿法制备磷酸钙化合物的原理和工艺条件选择进行热力学分析，以期建立新的制备工艺。热力学分析中所用的PK数据取自文献。’“。2．1．1磷酸钙化合物在水溶液中的离解作磷酸及多级磷酸根离子在水中的分布图以及各种磷酸钙化合物的igECa]，——pH图。2．i．1．I磷酸及多级磷酸根离子在水中的分布图磷酸在水溶液中的离解反应式为(1)、(2)、(3)式：PKH++PO,”=HP042一一12．35(I)H++HP04”=H。PO。一一7．20i(2)H++H。P04。=H。P04—2．15(3)由平衡方程式可得磷酸及各种磷酸根的总浓度：[P]，=[p043‘]+[HP042一]+[H2P0。一]+[心P0；]=[P04卜](1+lO咔“一M+10-张2-pKI+硎+10—PK3_雕2-M1-3州)=[P04”]巾，(4)巾，为pH的函数关系：巾P=I+10呻‘1州+10斗船蠛H附+10黔呲碟11蹦(5)磷酸及各种磷酸根在溶液中的分布系数n。为：ⅡPO。1=[P043。]／[P]，--1／巾，(6)ⅡHP042一=[HP吼”]／[pL=lO-"’”／巾，(7)ⅡH2PO．一=[H。P04-]／[P]，=10一阿2’P“吨PH／m，(8)ⅡH。P仉=[mPO。]／EP3，=10“””+“’3”／巾，(9)对(6)、(7)、(8)、(9)式用Excel软件迸行计算并画o。——pH关系图见图2．1，Ⅱ为分布系数。 竖!!查兰堕：!：兰堡堡塞2。HaPO。H2P04。HP04}P04}m2．1水溶液中磷酸和各级磷酸根阴离子分布围Fig．2．1DistributingdiagramofH3PO·。H2P04-，HP旷andP旷inwatersolutiOn从图2．1可以看出，随着pH值的增大，溶液中含P优势组分从H，P0t(水)变化到P03一。。．2．1．1．2绘制各种磷酸钙化合物的lg【Ca】t——pH图HA的溶解平衡方程式如(11)式：Ca；(PO。)，OH=5ca2++3P04。+OH—PKII^=57．80[ca”]j[P0。]3[oH一]=10_中“[P]，=3／5[Cd+]。[Ca’]，=[Ca2+]十【CaOH+]Ca2'+OH‘=Ca0H+PK=一1．30[Ca2+]。=[Ca”](1+101‘⋯。14)令是：(1+10“””“)。1则[Ca2+]=A[Ca”]t[P043+]：[P]斗qP0{3一[p吼”]=3／5[Ca”]T奉aPO,”将[Caz+]、[P02。]代入(11)式，并将[0H一]改写为10”“(A[C8z+]，)5(3／5[Ca2+]，a。)310”。4=10‘578两边取对数并整理得：lg[Ca2+]，．。=一5．391+1／8(519(1+10”。27)一PH一3lgQPO,”^^^)))m脚m㈤㈣㈦∽㈣㈣㈣㈨ 塑查型!壁墼塑墨堑羔量笪丝壅鱼丝整塑堑壅——TCP的溶解平衡方程式如(22)式：Ca。(PO，)：=3Ca2++2PO，”Pk”：28．7422)[Ca2+]3[PO。”]2=10+“(23)[P]，=1．5[Ca2+]，(24)由(24)式及(18)式得：EPO。”]=1．5[Cr]，nP04”(25)将(17)式、(25)式代入(23)式得：A[Caz+]，)3(1．5[Ca2+]，d。)2=101870426)lg[ca”]．．。，=-5．810+1／5(319(1+10”。12。7)一219QPO,”)(27)二水磷酸氢钙CaHPO,·2H20(DCPD)的溶解平衡方程式如(28)式：CattPO，·2H。0=C酽++HPO”。+2H20PKm=6．58(28)[Ca2+]EttP02一。]=lff”429)[P]，=[Ca”]。(30)[PQ?一]=(P]≯Ⅱeo：一：(31)．‘．[HP02—4]=[Ca2+]，dHP02-(32)将(17)式及432)式代入(29)式得：A[Ca2+]，[Ca2+]TdltP02’4=101”(33)19[Ca2+]。，。=一3．29+1／2(19(1+109””7)一lgdHPO”。)(34)对(21)、(27)、(34)式以pH为自变量，利用Excel软件计算绘图2．2。从图2．2可以看出，在pH<4。6的pH值下，DCPD稳定，在弱酸性介质下对生成DCPD有利。在pH>4．6的任何pH值下，HA最稳定，随pH的增大HA与TCP、DCPI)溶解度差异增大。在PH：11—13，HA与TCP的溶解度差异最大，从平衡的观点看，有利于HA的形成和TCP向眦的转变，易于得到单一HA相的沉淀物。总的说来，控制pH值(4．6，利于生成CaHPO。，控制pH值在1l—13利于生成Cas(POD30H，而要生成Ca。(PO。)。，pH值最好控制在7左右。 四川大学博}‘学位论文0-4-5『i：＼＼』：』：：：-．。．-T!?l’、1-．’、’’．．．．．-’。HA、‘、．～．二．，345678晶101’121314图2．2各种磷酸钙化合物的Ig[Ca】rpH图Fig．2．2Ig[ca】T—-HdiagramofDCPD，TCPandH^2．1．2磷酸与碳酸钙反应的可能性和限度碳酸钙为难熔化合物，溶解度比微溶的Ca(OH)2小得多，为了探讨采用碳酸钙作为ca的原料与磷酸溶液反应制备碳酸钙化合物的可能性，特作如下的热力学计算：CaC03+2H+一Ca2++C02+H20各物质的摩尔吉布斯自由能(Kcal／M01)为：t=25。CCaC03H+Ca2+C02If20AG。2∞(KJ)一294．8211．491—122．932—109．277—73．299—57．19由于体系中磷酸根的存在，CaC03溶解产生的ca2+迅速与HP04-2或P043。离子结合生成溶解度很小的磷酸钙。根据图2．2取【ca2+卜lO刁M，Pc02为气相中C02的分压，一般为0．03％大气压lip3×lO。2，在[H+]=10。6和10-rM，即溶液pH值分别为6和7时，根据范特荷甫方程式△G。。=△G。m+8．314×2981n!垒：半求出反应的自由焓△G：。分别为一29．09KJ和一14．53KJ，反应向生成Ca”和寺釜～一，．．．fL 周大利：磷酸钙系新型骨修复复合村料的研究C02的方向进行。反应速度除了受热力学的因素影响外，还有动力学因素的影响。反应生成的磷酸钙可能包裹在未反应的碳酸钙表面，如果形成致密的固膜，将使CaC03与H+的反应速度减慢。对于固液多相，减少反应物的粒径、增大反应界面是强化反应的重要措施，故选用微米级的CaC03粉末作为原料。由于反应中有C02气体产生，它在反应界面处释放，会阻止致密固膜的生成，有利于反应的持续进行。根据上述热力学分析，以细粒度CaC03代替Ca(OH)。与磷酸溶液反应是可行的，反应速度快，反应可以较快的进行到H。P0。被几乎耗尽为止，使Ca和P在液相的损失降低到最小程度。用CaCO。使eO。2一离子进入生成物晶格中，最终产物为含c0，2‘离子的磷酸钙。2．2磷酸三钙前驱体制备的实验研究2。2，1原料、分折及检测方法·目前许多研究者在制备磷酸钙类化合物时都是采用化学试剂作为原料，因而很难保证工艺对原料试剂纯度和粒度的要求。本研究采用自制高纯微细碳酸钙微粉为原料，保证了实验对碳酸钙粉末的纯度和粒度要求。沉淀物、滤液和煅烧产物的Ca、P含量按照国家标准GBl871—80磷精矿和磷矿石中磷和钙含量的分析方法进行，磷采用磷钼酸喹啉重量法，钙采用EDTA容量法进行分析，然后计算钙磷摩尔比。用JL—l155型激光粒度分布测试仪测定粉末的粒度分布。TCP晶型采用D／max—IIIx一射线衍射分析测试仪。2．2．2TOP前驱体制备制备方法介绍：A法：反加料，将CaCO。料浆加入磷酸溶液中。A-法：将磷酸配成1．43M溶液，自制高纯微细CaC03(d=2．6lam)调和成固：液=1：2的浆料。在2512T搅拌磷酸溶液，按Ca／P=1．51在反应不冒槽的前提下将料浆在4分钟内快速N／x．。搅拌lO分钟停止反应。A。法：步骤和条件如A-法，但在搅拌的同时开超声波振荡分散。A。法：高纯CaC03(d=4．19um)，其它步骤和条件同A。法。3B 凹JII大学博士学位论文A。法：高纯CaCO。(d=4．19um)，其它步骤和条件同Az法B法：顺加料，将磷酸加入CaCO。料浆中。Bi法：将高纯CaCO。(d=2．6um)调和成固：液=l：5．5的浆料，在25。C下搅拌，按Ca／P=I．51滴加3．7M磷酸溶液，反应在50分钟内完成，PH值始终保持中性。B。法：步骤和条件如Bl法，但在搅拌的同时开超声波振荡分散。B。法：高纯CaCO。(d=4．19um)，其它步骤和条件同Bt法aB4法：高纯CaCO，(d=4．19um)，其它步骤和条件同B：法A法的反应体系只是反应最初2—3分钟为酸性，随后为中性。控制反应物配料为Ca／P=I．51时，利用A法和B法均能制备化学组成为Ca。(P0，)：nH：0的非晶态TCP的前驱体，其XRD图谱表现为主衍射峰宽化，不能在JSPDSPDF卡片上找到相对应钙磷晶型化合物xRD图谱。图2．3为A法制备的TCP前驱体XRD图谱，图2．4为B法制备的TCP前驱传XRD图谱。图2．3^法制鲁的TCP葡驱体XRD图谱图2．4B法制备的TOP前驱体XRD图谱Fig．2．3XRDspectraofthepredecessorFig．2．4XRDspectreofthepred8ce8so．‘。ofTOPpreparetedbyAmethodofTCPprepsretedbyBmethod2．2．3制鲁实验结果2．2．3．1制备方法对前驱体粒度分布的影响A．法所制得的TCP前驱体dw22．049m。A。法所制得的TCP前驱体d。=1．32um，粒度分布见图2．5。A。法所制得的TCP前驱体d50=4．52uma 周大利：磷酸钙系新型骨修复复合材料的研究A。法所制得的TCP前驱体ds0-3．54u111。B。法所制得的TCP前驱体ds0-2．52Hm。B：法所制得的TCP前驱体d。=1．52um。B。法所制得的TCP前驱体d。。=3．52“111，粒度分布见图2．6。B。法所制得的TCP前驱体d。=l，64uHI，粒度分布见图2．7。由制备方法比较可知，采用将细颗粒CaCO。打浆，在不造成反应速率过快引起冒槽的前提下，将浆料加入搅拌和超声波作用下的磷酸溶液中可制备细粒度TCP前驱体(A。法，d。=1．32unl,)。采用粗粒度cacO。打浆，不采用超声波分散时可制各粗粒度TCP前驱体(A。法，d。=4．521．tm。)；采用粗粒度的CaCO。，将磷酸溶液滴加入搅拌下的CaCO。浆液(不用超声波)制得的TCP前驱体粒度较粗(B。法，d。=3．52um)。圈2．5Az法所制得的TOP前驱体粒度分布围Fig．2．5ThedistributionofpredecessordiamoterofTCPproparetedbyA2method围2．6酗法所制得的TOP前驱体粒度分布围Fig．2．6ThedistributionofpredooossordiameterofTCPpreparetedbyB3method40 四JII大学博士学位论文圈2．7B4法所制得的TCP前驱体粒度分布图Fig．2．7ThedistributionofpredecessordimeterofTCPpreparetedbyB．mthod2．2．3．2CaCO，粒度对制备TCP前驱体粒度的影响CaCO。粒度越细，比表面积越大，与磷酸反应很快溶解近完全，体系pH值迅速上升N6—7，生成的大量Ca。(P04)。·nH：0微粒在短时间内析出，体系中Ca”、P吼‘3迅速下降，使已析出的Ca。(p瓯)。·nH20微粒包裹沉淀长大作用不明显，加上超声波的分散作用，削弱了微粒间的凝聚长大过程，得到单分散性好的TCP前驱体。CaCO。粒度(jL-1155型激光粒度分布测试仪测试)对制备TCP前驱体粒度的影响见表2．1。表2．1TCP前驱体粒度随原料cacos粒度变化关系TabIe2．1Effectsofd∞ofCRC03ond∞oftheTCPpredecessor2．3高温煅烧制备d-TCP、B-TOP陶瓷粉寒研究2．3．1实验将不同粒度的TCP前驱体在高温下煅烧成。一TCP、B—TCP陶瓷粉末。磷酸钙类化合物包括不同Ca／P比的一系列磷酸钙化合物，它们的化学组成不同，同种化学组成的化合物在不同温度下煅烧又可制得同化学组成不同晶型的化合物。 周大利：磷酸钙系新型骨修复复合材料的研究参考CaO-P。0；体系温度一组成相图(图2．8)可以大致确定Q—TCP存在的稳定温度区。I：羞c越t．MC‘∥Pl铒分子比圈2．8千燥条件下CaO-P,Os的近似相闰Fig。2．8PhasediagramofCaO-P=Osindrynessconditi013从图2．8可以看出在CaO／PzOa分子比为3。0区域(Ca／P=1．50)，存在纯相磷酸三钙结晶区。0一TCP在1200℃以上稳定。但在实际烧成过程中，TCP的晶型转变温度与TCP前驱体的粒度、升温速度、保温时间有关，为此本研究采用d”21．52uIll的TCP前驱体进行了B—TCP、Ⅱ一TCP高温烧成实验。样品烧成后迅速取出室温急冷，以保证高温时的晶型。图2．9为在1080"C下保温煅烧40分钟，根据XRD图谱，烧成品全部为B—TCP。图2．10为在1150。C下保温煅烧40分钟，根据XRD图谱，烧成品全部为B—TCP。图2．11为在1200‘C下保温煅烧40分钟，根据XRD图谱，烧成品为B—TCP和a—TCP的混合物a图2．12为在1250℃下保温煅烧40分钟，根据XRD图谱，烧成品为a 四JII大学博士学位论文-TCP。图2．13为在1300。C下保温煅烧40分钟，根据XRD图谱，烧成品为Ⅱ一TCP。从煅烧实验可知，若要制备B—TCP，煅烧温度宜控制在1170。C以下，若要制备a—TCP，煅烧温度宜控制在1230"C以上。综合考虑晶型转变速度及防止高温烧结粒子长大，煅烧温度宜控制在1260。C左右，保温时间为1小时。篙星吕豳2．9在1080℃下保温煅烧柏分钟，烧成品XRD图谱Fig．2．9XRDspectraofproductcalcinedfor40minutesat1080℃笤星营吕图2．11在1200℃T保温煅烧柏分钟，烧成品XRD图谱Fig2-11XRDspeotraofproductcaIcinedfor柏miflutesat12∞℃吊而黜咒无船培元跚吊鬲荆吊不埔嘏吊吊需宇子争尹手掌图2．10在11∞℃下保温煅烧加分钟，烧成品XRD图谱Fig．2．10XRDspectraofproductoaloinedfor40minutesat11∞℃罄星罾景圈212在1250℃下保温煅烧加分钟，烧成品XRD图谱Fig2-12XRDSpeGtraofproductcaIcinedfor40minutesat1250℃暑．‰哥。勰 周人利：磷酸钙系新型骨修复复合材料的研究吕落蟹莒吕吊蟊≈冗五犯圯瓦吊冠吊鬲职承不螭螺幂吊艰早；牛旱}筝围2，13在130012下保温煅烧40分钟烧成品x∞圈谱Fiz．2．13XRDspectraofproductCaICinodfor40miflutesat1300℃说明：圈中d=3．214为B-TCP的衍射特征峰。2．3．2实验结果2．3．2．1TCP前驱体粒度对0【-TCP粒度之影响a—TCP粒度对水化反应、初凝实验、终凝时间、a—TCP骨水泥强度有很大影响。各种粒度TCP前驱体的煅烧温度为1260。C，保温时间为40分钟。TCP前驱体粒度对d—TCP粒度之影响见表2．2。由表2．2可看出，TCP前驱体的粒度越细，制备的Q—TCP粒度越粗，这是因为TCP前驱体的粒度越细，其表面活化能越大，在高温煅烧过程中，颗粒表面在转变成固熔体时，由于表面张力的作用，造成微粒聚集、烧结，使颗粒长大。而TCP前驱体的粒度较粗，制备的o-TCP粒度较细，这是因为大颗粒在高温煅烧晶型发生转变时，体积膨胀，内应力增大，大颗粒发生裂解，抵消了聚集烧结长大的作用。但随着煅烧时间延长，颗粒度将增加。裹2．2TCP前驱体粒度对Ⅱ-TCP粒度之髟响!些!!!：!!!!!!!!!!!!!垫!!!!!匹!!!!!!!!：竺壹!!!!!!一TCP编号l2345 四川大学博}学位论文2．3．2．2TCP前驱体粒度对O-TCP陶瓷粉末粒度之影响B—TCP粒度对B～TCP／PLLA强度及降解性能有很大影响。各种粒度TCP前驱体的煅烧温度为1150。c，保温时间为40分钟。TCP前驱体粒度对B—TCP粒度之影响见表2．3。表2．3TCP前驱体粒度对B-TCP粒度之影响TabIe2．3Theeffectsofd∞ofTCPpredecessorond∞oftheB-TCP由以上结果可知，TCP前驱体的粒径直接决定了B—TCP陶瓷粉体的粒径，TCP前驱体的粒径越小，B-TCP的粒径就越小。对于幽为0．79unl的B—TCP，其粒径分布较窄，而如为5．96pm和8．81t,till的B—TCP，其粒径分布较宽。图2．14为d50=O．79um的B—TCP的扫描电镜照片，图2．15为激光粒度仪测试的粒度分布图。从图2．14、15可看出，B—TCP的颗粒近似球型，粒度分布均匀。2-149-TCP的SEN照片(5000X)Fig．2．14selim_黔ofB—TCPpreparetedby乳method(5000X)2．4多孔B-TCP陶瓷的制备2．4．1实验2．4．I．】原材料圈2．15B-TCP的较度分布图(ds栅．79pm)Fig．2．15DisiributiorlofdiameterofB-ToP(d∞=o．79um) 旦盔型：堡墼塑墨堑型量堡壅茎鱼翌整塑堕塑————粘接剂：PVC溶液(3％)：成孔剂；20—30目的球形硬脂酸或柱状硬脂酸：磷酸钙原料粉末：各种粒度的TCP原料粉末；2．4．1．2制备方法步骤：(1)称取定量的磷酸钙原料粉末，加入相应量球形硬脂酸或柱状硬脂酸混合均匀，用PVC溶液调和，在模型中压模；(2)在90。C下烘干：(3)按一定的升温制度升温和在特定温度下烧成，并保温40分钟。2．4．2实验结果2．4．2．I多孔D-TCP陶瓷内部孔道形式研究TCP前驱体的粒度为d。=1．32unl，煅烧温度为1t504C，保温40分钟。孔隙率为55％。图2．16所示样品为球形孔多孔0一TCP陶瓷照片；图2．17所示样品为柱状孔多孔13-TCP陶瓷照片。从图2．16、图2．17可看出，柱状硬脂酸成孔的多孔B—TCP陶瓷内部孔道互相贯通，便于吸载和释放BMP以及13一TCP的溶解。雨球形硬脂酸成孔的多孔-TCP陶瓷内部孔道贯通性较差，需要在植入～段时间后，随着TCP的逐步溶解，大孔道才相互贯通。陶瓷体的大孔孔径在400—700um。小孔径在10一30pm。2．4．2．2D—TCP载体的化学成份分析用X_射线能谱仪分析B-TCP载体的化学成份，对其化学成份进行分析。x一射线能谱分析结果见图2．18。图2．18中有两个钙峰值和一个磷峰值，并可见钙、磷的原子百分比和重量百分比分别为：钙60．59％、66．48％，磷39．40％、33．51％。钙磷原子数量百分比为1：1．54，是近似磷酸三钙的钙磷理论比值。本课题采用反向包裹法制备的TCP前驱体是含微量C0。2一根的前驱体，用此前驱体制各B—TCP陶瓷及。一TCP骨水泥，微量c0。2。离子进入生成物晶格中，最终产物为含c03”磷酸钙。C032一引入是有益的，也是必需的，这种含c032一磷酸钙在植入后反应中生成含cO。’的类骨羟基磷灰石有利于骨性结合促进骨的生长。 四川大学博=E学位论文图2．16球状孔多孔B-TOP陶瓷照片(20X)Fig．2．16SectionPicturasofB—TOPporousbuIkcoramiCS_ithSphericaIhoIas(x20)圈2．”柱状孔多孔B—TCP陶瓷照片(20X)Fig．2．17SectionDicturesofB—TCPporousbuIkceramiCS-ithColumnarhoIes(x20)b．宣舅L一。队日0∞B-5vFS‘‘拼l口24a圈2．188-TGP载体的x一射线能谱仪分析谱图Fig．2．18SENI—quantitativaanaIysi8resuItforB—TOPbuIkceramiCS2．4．2．3TCP前驱体粒度对D-TCP陶瓷抗压强度之影响TCP前驱体粒度对B—TCP抗压强度之影响见表2．4实验条件：粘接剂为3％Pvc溶液，成孔剂为20-30目球状硬脂酸。TCP前驱体粉与成孔剂的重量比为10：4．5，压制成型。烧成升温速度：常温-900℃为90分钟，900-1100℃为80分钟，1100-1150℃为30分钟。1150℃下保温40分钟。由表2．4可看出，TCP前驱体的粒度越细，制备的多孔6一TCP陶瓷烧结体抗压强度越大，这是因为TOP前驱体的粒度越细，其表面活化能越大，在高温煅烧过程中，微粒聚集、烧结，形成致密骨架，使陶瓷体强度增加。47 旦查型!壁墼箜墨堑型量堡堡堡垒塑翌堕!兰——————————一襄2．4TGP前驱体粒度对p—TCP抗压强度之影响TabIe2．4Theeffectsofd∞ofTCPpredecessoroncompressive!!!!!壁!!!!：!翌一一一一一2．4．2．4孔隙率对多孔D-TCP抗压强度之影响多孔B—TCP样品的制备用d。=1．32um的TCP前驱体粉料，加20一30目球状硬脂酸调节孔隙率，烧结温度为1150℃，保温40分钟。孔隙率对多孔B—TCP抗压强度之影响见表2．5。裹2．5孔隙率对多孔13-TOP抗压强度之影响Table2．5TheeffectsoftheporesityonthecomPressivestronRthofl3-TOP从表2．5可知，随着孔隙率的增加，为了保证多孔B—TCP陶瓷体一定的强度多孑L13一TCP陶瓷体的抗压强度降低，孔隙率宜控制在65％以下。2．4．2．5多孔D-TCP陶瓷体外溶解速率将图2．16、图2．17所示多孔0-TCP陶瓷体经表面处理后，用生理盐水浸泡并用蠕动泵循环泵送液体使浸泡液处于微湍动状态，模拟人体体液微循环状态。由图2．18可看出，本研究用新工艺制备的多相同孔隙率下，柱状孔多孔13：-TCP陶瓷的溶解速度快于球形孔多孔§_TCP陶瓷。孔隙率较小的多孔B—TCP陶瓷其溶解速度相对较小。孔B-TCP陶瓷体在模拟人体体液环境情况下，溶解性能良好，能为新骨生成提供丰富的Ca、P。 四川大学博士学位论文售¨广三曼100246810t2】4t6浸泡时间，天图2-18多孔B—TcP陶瓷在生理盐水中的溶解曲线Fig．2．18SoIubiIil：ycMrv@ofl3一TOPporousbuIkceramicsinphysiologicalsalinesolution2．5本章结论1．本新工艺的创新点在于：采用超细CaC03粉末、反加料，用超声波分散，反应时间短，制得的TCP前驱体粉末粒径细而均匀，分散性好。所得TCP沉淀过滤性能好，克服了常规湿法制备生成无定形TCP沉淀物难于过滤的难题，免除了长时间(一般24]J、时以上)陈化的过程，提高了效率：TCP前驱体是含微量C032‘根的前驱体，用此前驱体制备B-TcP陶瓷及a-TCP骨水泥，微量C032。离子进入生成物晶格中，最终产物为含C032一磷酸钙。在体内降解后生成含COg2‘类骨磷灰石，促进新骨生成：由于TCP粒度细，表面活化能高，煅烧过程中聚集、烧结形成牢固的骨架，有利于陶瓷强度提高。2．根据热力学分析指导及不同原料粒度、加料方式和强化搅拌方法研究，本新工艺优化的工艺条件为：(1)将磷酸配成1．43驵溶液，自制高纯微细CaCO，调和成固：液=1：2的浆料。在25℃下搅拌磷酸溶液，按ca／P=1．5l在反应不冒槽的前提下将料浆在4分钟内快速加入，搅拌10分钟停止反应。(2)制备B—TCP的煅烧温度宜控制在1170。C以下：49 周大利：磷酸钙系新型骨修复复合材料的研究(3)1230"C以上为。一TCP的稳定区，烧成反应的温度宜控伟0在1260V左右，保温时间为l小时，采用骤冷方式制备高纯微细a—TCP微粉。(4)用柱状硬脂酸作致孔剂制得的多孔13一TCP陶瓷内部孔道互相贯通，有利于体液在陶瓷中的微循环，加速TCP溶解；制备BUP／9一TCP复合人工骨材料时，有利于BMP的吸载和释放；(5)可根据需要通过选用不同粒度的CaCO。、致孔剂形状、用量，调节0一TCP陶瓷的孔隙率大小和孔的结构，从而控制陶瓷的强度和溶解速度。50 删JII大学博士学位论文第二章参考文献1．张昭．n一磷酸三钙类生物活性骨水泥的化学基础研究．四川大学博士学位论文，成都，中国，1999．2．周馨．新型磷酸钙生物活性骨水泥的合成、自凝动力学及兔颅骨缺损修复动物模型试验的研究．四川大学博士学位论文．成都，中国，1998．3．王勃生，孟庆思，高振英等．生物材料的战略意义及近期发展方向．材料导报，1993，(3)：1454．Bermudez，DevelopmentofsomeCalciumPhosphateCementfromCombinationsofa—TCP，MCPMandCao。J．Mater．Sci．：Mater．InMed，1994：5：160—163．5．F．C．M．Driessens，扼G．Boltong，0．BemudzeandJ．A．Planell，FormulationandSettingTimesofSomeCalciumOrthophosphateCements：APilotStudy，J．mater．Sci．：Mater．inMed．．1993：4：503—508．5．F．C．M．Driessens，M．G．Boltong，0．Bemudze，J．A．Planell，M．P．GinebraandE．Fernandez。EffectiveFormul8tionsforthePreparationofCaciumPhosphateBoneCements，J．mater．Sci．：Mater．inMed．，1994：5：164—170．6．BrownWeandChowLC，USP4518430，1985．7．Bermudezeta1．，OptimizationofACaciulmOrthophosphateCementFormulationOccuringintheCombinationofMonocaciumPhosphateMonohydratewithCalciumOxide。J．mater．Sci．：Mater．inMed．，1994：5：67—71．8．W．E．BrownandL．C．Chow。in“CementResearchProgress”，Ed．ByP．W．Brown，Am．Ceram．Soc．Westerville，0hio，1986：352～379．9．K．Ishikawa，Y．Miyamoto，M．Koneta1．，Non～decayTypeFast—SettingCalciumPhosphateCement：CompositewithSodiumAlginate。Biomaterials。1995：16(7)：527-532．10．KurashinaKeta1．。Jpn．J．Oral，Maxillofac．Surg．，1992．38：32511．KurashinaKetal，Invitrostudyofacaclciumphosphatecementsconsis'tingofa-tricalciumphosphate／dicalciumphosphatedibasic／tetrecalciumphosphatemonoxide，Biomaterials，1997：18：147．12．KlawitterJ，HulberS．Applicationofporousceramicsfortheattachmentofloadbearingorthopaedicapplication．JBiomedMaterRes．1971：2：161—167．51 岗大乖j：磷酸钙系新型骨修复复合材料的研究13．FlatlyT，Lynchi，BensonM．Tissueresponsetoimplantsofcalciumphosphateceramicinrabbitspine．C1inOrthop．1983：174：246—252．14．KleinCPAT．Biodegradationbehaviourofvariouscalciumphosphatematerialinbonetissue．JBiomedMaterRes．1983：17：769—784．15．杨连甲，金岩，胡蕴玉．口腔和骨科的生物活性材料：原理、应用、进展．西安：陕西科学技术出版社，1993：164．16．PihlajamakiH，Bostman0，MauninenM．eta1．Absorbableplugesofself—reinforcedpoly—L—Lacticacidintheinternalfixationofrabbitdistalfemoralosteotomies．C1inOrthop，1994：298：277—285．17．$orchoM．Calciumphosphateceramcsashardtissueprosthetics．C1inOrthop，1981：157：259—278．18．杨显万，高温水溶液热力学数据计算手册，北京．冶金工业出版社。1983．19．W．E．Brown．“SolubilitiesofphosphateandotherSparringlySolubleCompounds”，Chapter10，EnvironmentPhosphorusBandbook，JohnWileyandSons，1973：203-239． 四川I大学博士学位论文第三章BMP／a一磷酸钙骨水泥生物复合材料制备、性能及兔颅骨缺损修复实验研究在骨缺损修复的研究领域，由于羟基磷灰石陶瓷(hydroxyapatiteceramicHAC)具有很好的生物相容性，不会引起炎症及受体区周围细胞的毒性反应，特别是它具有传导成骨活性而能与受体骨发生直接的骨结合“。1，问世以来受到了广大临床医生的关注。但是无论是颗粒型或大块型的HAC，因为均是陶瓷结构，故其本身有难以克服的缺限：大块型难以塑形，外观不能达到美容效果；材料难于和骨缺损缘密切接触，不利于界面间传导性生成新骨；颗粒型则由于缺乏形态稳定性，不但难保持所要求的形状，而且易于滑出“’8-10]使HAC的应用受到了很大限制。加以HAc较难降解吸收，将成为长期植入体内的异物而存留。由于磷酸钙骨水泥(calciumphorphatebonecements，CPBCs)的问世，使上述陶瓷结构的问题得到了相应的解决。Brown和Chow首先研制出的CPBCs”1不属陶瓷类，可以不预先成形，所以膏状物置入缺损处而后在体内固化，最终转化为HA等磷酸盐晶体。其特点如下：(1)具有与骨相似的无机矿物质成份；(2)可在室温或体温下等温现场自固化；(3)可被注射到骨折部位或缺损区；(4)其固化的强度大于松质骨；(5)有传导成骨活性，可与骨形成真正的骨连接o。“。1“。采用注射法将成骨材料注入骨缺损区并非新概念，早在1892年Dreesman就曾尝试用主要成分为硫酸钙的石膏糊(piasterofparis，PP)修复骨孔洞““，但由于PP固化时产生大量热及杂质对机体有损害而被放弃。3．1磷酸钙骨水泥概述3．1．I磷酸钙骨水泥的化学组成多种成份可经化学反应形成磷酸钙沉淀，如Driessens及其同事“7’”1就曾经试验过100多个可发生沉淀的配方，其中有超过15种配方可以达到的自固化的要求。根据沉淀磷酸钙类型的不同，CPBCs可分为四种类型：1)透钙磷石型(Brushites)：2)HA型：3)缺钙HA型(Calcium-deficienthydroxyhpatitie，CDHA)；及4)无定型磷酸钙型(Amorphouscalciumphorphate，AMCP)。其中以缺钙型最接近骨的无机盐成份。但无论其成份如何，CPBCs均有固液两相，固相主要由各种磷酸钙盐组成，液相为去离子水或磷酸溶液，少数也有用硫酸 旦查型!堕墼塑至堑型量堡堡堡垒塑塑塑塑!L．——盐者(Frayssine]等，1997)fl‘]o目前配方中主要的磷酸钙盐见表3．1。表31主要的磷酸钙盐TabIe3．1PrimarycaIciu冉phosphate表中所列磷酸钙，在37'(2HA的溶角翠性最差，PH值低于4．2时DCPA最难溶解，PH低于8．5a寸TTCP的溶解性最好，面PH值高于8．5对，DCPD的溶解性最好。Chow认为各种磷酸钙盐的不同溶解性，是CPBCs固化反应的主要驱动力。3．1．2磷酸钙骨水泥的理化特点3．1．2．1固化及田化时间CPBCs经水化、沉淀反应后，其终产物是HA等磷酸盐结晶，固化后的CPBCs具有微孔结构“‘”’”“。实验证明，增加液相中的磷酸盐可使HA的形成增多。当以水为液相时，由于TTCP的高度可溶解性(在中性或酸性环境中)，可提高磷酸盐浓度，使之达到所需水平从而加速HA结晶形成，而HA的快速形成是达到快速自固化(<30分钟)的关键因素，所以TTCP常作为CPBCs的基本成份。Chow等(1994)。o观察到，以磷酸盐为液相时，固化时间可由30分钟缩短到5分钟。Takagi等(1998)””制备出一种不含TTCP的CPBCs，其固相包括DCPA、DCPD、a—TCP及补充钙盐成份氢氧化钙和碳酸钙，液相为磷酸盐溶液(≥0．2mmoIL1)，结果CPBCs于5—30分钟内固化，24d'时形成HA终产物。通过X54 四JII大学博士学位论文线能量衍射分析，提示其固化是由于高浓度磷酸盐溶液使HA快速形成而加速的，但其理化性质仍与TTCP型CPBCs相似。影响CPBCs固化时间的因素还有很多，如Lacout等””1996发现其固化时间随着固相中MCPM含量的增加而延长，液固比率(体积／重量)降低则使固化时间缩短、提高温度也可使固化时间缩短。另外固相颗粒的大小形态也对固化时间产生影响。Chow的实验证明“⋯，在固相中加入一定量的晶种如HA等，也可加快固化时间。但在颅骨缺损成形中，固化时间要求适当，过长，过短，均有碍于手术操作和成形效果。3．1．2．2磷酸钙骨水泥强度及微观结构CPBCs的机械强度来自固化体晶状结构的交联互织结合形态““，为了使CPBCs达到一定的强度，原料矿物质必须在溶液中能够溶解并再次晶体化。Ishikawa(1999)Ⅲ1对TTCP或DCPA含量不同的CPBCs(TTCP／DePA克分子比为0．25—2．0)其固化时间和强度进行了研究，发现当TTCP／DCPA克分子比率=l时，HA形成最快，固化后强度最大，二者克分子比偏离1时，固化体强度下降。Constomtz等(1995)。”研究发现NormianSRS(商品名，固相成份为MCPM+0一TcP+碳酸钙(cacliumcarbonate，CC)液固相混合10分钟后可获得IOMPa的初始抗压强度，12小时后强度达高峰，抗压强度为55MPa(大于松质骨)，而抗张强度为2．1MPa(约等于松质骨)；BoneSource(商品名，固相成份为TTCP+DCPD)在混合44,时后抗压强度达到37—60MPa“⋯。Chow(1991)“”发现CPBCs固化后抗压强度为34-51MPa，抗张强度为12MPa。Yamamoto等(1998)。”对CPBCs的强度作了体内外对比研究，发现两种配方的骨水泥(A：dTCP95％+DCPD5％：B：Ⅱ一TCP90％+DCPD5％)虽然强度不相等，但体内外强度比较及体内强度转化结果基本一致，配方A在早期抗压强度(3天内，51．3MPa)虽小于B(57．OMPa)，但一周后A的强度却超过了B，4周时配方A、B的强度分别为57．5MPa和47．1MPa。体内试验两者强度也有相似改变，配方A、B两型CPBCs的体外强度均是其体内强度的约2倍，认为可能是CPBCs受体液影响的原故。无论三种CPBCs是在体内或体外，其强度均在2周时最大，以后强度呈缓慢下降趋势。作者认为CPBCs再结晶在2周时达到高峰，故此时其强度最大，以后随溶解及吸收体强度逐渐下降。这一结果进一步证实CPBCs在体内可被降解吸收和再塑形汹’⋯，估计在新骨逐渐形成和替换CPBCs之后，其强度将会有新的调整。EE 璺查型!壁塑塑墨堑型量竺墨墨全堑型箜竺塑———————————一Lacout等(1996)。53研究发现，CPBCs强度受以下因素的影响：(1)固相的组成：(2)液相中磷酸的百分比浓度；(3)液／固比。并认为下列条件可获得理想硬度：磷酸0．3-0．2％，液／N比(ml／g)0．4-0．45，MCPM的化学计量系数为0．475—0，57。Chow(1991)04还发现CPC的强度受孔隙率、颗粒大小及HA引物的结晶度影响：孔隙率越高，强度越低，而孔隙率与液／固比密切相关；含有高结晶度HA固相成份的CPBCs硬度低，而含大的TTCP颗粒及小DCPA颗粒的CPBCs强度高。对CPBCs微观结构研究的结果，Constantz等(1995)523认为固化后形成的磷酸钙结晶在晶体形态学上与自然骨非常相似，晶体大小约20nm，孔隙直径为30nm：而Frayssient等(1998)“”的观察结果是，CPBCs密度为1．43，孔隙率45％，孔隙平均直径约7．1pm。上述CPBCs孔隙率及孔隙大小的不同，主要是由于原料中固相成分及固相颗粒大小的不同造成的。3．1，3磷酸钙骨水泥在体内的降解、结晶过程CPBCs固液相按一定比例混合后，先形成一种可以任意塑形的膏状物，经注射或其它外科手段植入到骨缺损部位。固化时间一般在30分钟以内，但结晶反应的最终完成则须数小时或更长时间lilt,IB,361o所以结晶是在体内完成的，CPBCs在体内的过程包括再结晶的最终完成、塑形、降解吸收以及成骨作用的发挥。3．1．3．1磷酸钙骨水泥的降解及吸收很多实验表明，CPBCs可体内降解吸收，但其吸收速度和降解过程中是否伴有修复区体积的丢失及强度的降低，吸收与成骨过程是否等量同步进行，这些人们最关心的问题还待研讨。Kurashina等(1997)。”将CPBCs分别植入骨缺损区及肌袋内6、12、18个月，发现各个阶段均有因吸收而形成的材料表面粗糙现象。虽然各阶段吸收率不同，但总是随时间延长而吸收增多。肌区内材料吸收最快，其次是骨区内与软组织接触的材料面，而与骨相接触的材料面吸收最慢，提示与体液接触是CPBCs体内降解吸收的一个重要因素，骨组织阻挡了体液与CPBCs的接触而使相应区域吸收减慢。不过CPBCs降解吸收的速度甚慢，即使在吸收最快的肌区，18个月后CPBCs的吸收率也不超过50％。实验还证明，膏状CPBCs与固体CPBCs体内反应不同，前者表面积聚大量的多56 四川大学博士学位论文核巨细胞，而固体材料表面则较少见到，提示经注射置入体内的CPBCs其降解吸收要快于固体者。关于CPBCs体内降解吸收的机理，目前认为有两条途径：1)材料本身在体液中的溶解；2)吞噬细胞的吞噬过程。’”1。3．1．3．2磷酸钙骨水泥的成骨作用当CPBCs植入骨缺损区后，立即适应缺损而塑形，与缺损达到高度整合，而后在成骨细胞和破骨细胞的作用下转化成新骨。这一过程称传导性成骨(osteoconduction)或转导性成骨(osteotransduction)04’”]。动物实验证明，将CPBCs植入骨缺损区域或颅骨骨膜下均可刺激新骨生长，而且发现CPBCs的吸收与新骨生成相协调，即材料降解过程中逐渐被新生骨组织代替，不发生容积丢失及强度的降低“4。“1。也有的实验发现，当CPBCs被新生骨包围后其吸收减慢，但它与软组织接触面因持续吸收而表现出凹凸不平，说明虽然速度较慢，长时间体内过程仍可导致材料体积的丢失。“3“。Fragesinet等(1993)021观察到HA陶瓷与CPBCs成骨作用发生的机理不同。在陶瓷材料，成骨细胞的分化优先发生于其表面，而后由成骨细胞合成骨基质，生成不成熟新骨，当新骨层全部覆盖材料表面后，骨组织即向孔内延伸，并逐渐完成传导性成骨。在CPBCs，成骨细胞很少在材料表面出现，多数成骨细胞在离开材料表面一段距离的组织内分化，新骨(网织骨)生成由自体骨缺损边缘向材料方向生长，进而占据材料被吸收后所留空间(在植入早期可在CPBCs表面与网织骨之间发现异染基质)。造成CPBCs这种成骨方式的原因可能是：CPBCs材料的易溶解性使之在其表面形成了理化性质不同于陶瓷的界面微环境；CPBCs表面不稳定性和可吸收性；CPBCs吸收太快以致新骨(由于生长慢)无法与材料表面接合。3．1．4磷酸钙骨水泥作为载体的研究由于CPBCs固化后可形成微孔结构，并且能够体内降解吸收，目前很多研究把它当作一些药物或生物活性因子的载体和缓释系统。Yu等(1992)5“用CPBCs与头孢氨苄和诺氟沙星混合制成小丸，体外观察药物的释放行为，发现上述药物与CPBCs的混合不影响后者的固化过程，药物在PBS缓冲液中的释放遵守Higuchi氏方程式，提示药物是通过扩散的方式从CPBCs中释放出来的。57 阁大利：磷酸钙系新型骨修复复合材料的研究Hamanishi等(1996)⋯1等在CPBCs作为万古霉素的载体释放系统的研究中发现，含有1％万古霉素的CPBCs，万古霉素在PBS缓冲液中的有效释放可持续2周，当万古霉素量增加到5％时，则可持续达9周以上。含有5％万古霉素的CPBCs植入骨组织3周后，骨髓中的万古霉素平均浓度高达其最低抑菌浓度的20倍，而CPBCs作为BMPs载体释放系统的研究也有报导”“1。Ohura等(1999)“”将固化后的cPgCs小圆柱体(4×5吣)载负不同剂量的rhB酶P2(1．26或6．29mug)植入大鼠股骨缺损区内，并与单纯植入CPBCs者相对比。结果发现，6．28mug组引起缺损区大量新骨生长，在材料表面形成壳状。3N时全部缺损发生骨连接，6N时观察到CPBCs吸收并被长入的新骨取代，9N时扭转试验发现其抗扭转及硬度分别恢复达99％和141％，小剂量rhBMP2组可恢复40％和41％，对照组则骨不连接，充分证明CPBCs作为BMPs载体缓释系统的可行性。另外，CPBCs作为牛胰岛素、白蛋白、消炎痛、阿斯匹林载体缓释系统的研究也取得了较满意的结果‰5”。3．1．5(；PEGs作为骨缺损修复材料存在的问题CPBCs用来修复非承重骨如颅、面、颌等。其强度已足够，目前国外已有该类市售产品并试用于临床，进行颌面整形、颅骨缺损修复及颅底重建等⋯’[5,44-49]o但有关CPBCs的基础及应用问题等尚须进一步研究解决。目前有的研究发现CPBCs的吸收与成骨作用不相平衡，吸收后的空间被软组织占据，降低了修复区的强度，说明应进一步提高其成骨活性⋯1⋯，成骨材料接触体液如血液时可影响CPBCs的固化甚至强度，因此改进CPBCs内聚力的研究也在进行(Kbairoum等，1999)”⋯；BoneSource的CPBCs要求在修复直径≥4cm颅骨缺损时应用金属网架加强材料，这就增加了手术的复杂性，也需研究解决(Friedman等，1999)““”1。总之，CPBCs做为一种大有前途的颅骨成形材料，在临床广泛应用之前仍需作进一步的研究加以改进。为加速成骨过程，需采用具有骨诱导作用的生物活性分子如BMP与CPBs复合，植入体内促进新骨生长。本章将围绕BMP／a—TCP复合人工骨进行以下几个方面的研究工作：(i)研究a-TCP原料粉不同煅烧工艺条件对Q-TCP的自凝和水化性能的影响。 则川大学博}学位论文(2)比较不同粒度的n—TCP原料粉对CPBC的凝结和抗压强度的影响，研究辅助料及促凝剂加速CPBC凝结速度的作用机理。利用显微摄象技术研究a—TCP骨水泥的硬化过程。(3)牛BMP提纯及活性鉴定(4)BMP／a—TCP骨水泥制备(5)BMP／a—TaP骨水泥蛋白释放动力学试验(6)BMP／Q—TCP骨水泥复合材料修补兔颅骨缺损的动物模型实验研究3．2a-TCP骨水泥水化性能研究3．2．1实验(1)采用骨水泥初凝和终凝时间来评判骨水泥的凝固性能。本实验中a一磷酸钙骨水泥凝结时间的测定采用吉尔摩针法，即自制两支重量分别为1139和549、针尖直径分别为2．1mm和1．1mm的吉尔摩粗细针，分别用于测定初凝时间和终凝时间。强度测试采用JS～14单颗粒抗压强度自动测量仪一II进行测试。骨水泥凝结过程采用COIC光学显微镜摄像观察。(2)不同粒度的a—TCP原料粉用调和液调和，调和液为0．25MNaH。P仉／Na。HP04混合溶液，[P]，=0．5M。调和固液比为1：0．40。(3)将调和好的骨水泥放入Hank’s溶液中浸泡，测定不同时间对骨水泥强度的影响。Hank’S溶液的配制：50m1C+50m1D+24mlE+90m1H20+数滴CHCl3A．NaCl1609+KCl89+MgSO。7H2049溶于800ml水中B．CaCI。2．89溶于lOOml水中C．溶液A+溶液B+H。OIOOml+CHCla2MLD．Na2HP04．12H。01．69+NaH2P04．2H202．269+d、葡萄糖20．Og+CHCl32ml溶于800ml水中，稀释至1000mlNaHC0379溶于500mlH：0得到1．4％的NaHCOs溶液。3．2．2．1Ct．一TCP粒度对c【-TCP骨水泥凝固性能影响a—TCP粉末的粒度对a—TCP骨水泥凝固性能影响见表3．2，以其初凝时间59 丝查型!堕塑塑至堑型量堡墨墨鱼丝型堕堑苎——————————一和终凝时间为判断依据。由表3．2可看出，为了保证。一TCP骨水泥凝固，a—TCP原料粉的粒度如应小T7um。使用纯。一TCP作为骨水泥粉，为满足手术要求，n—TCP粉料的中位径d；。应采用1．5um以下，可采用A3法制各。表3．2n—TCP粉末的粒度对n-TCP骨水泥凝固性能影响TabIe3．2EffectsofpartiCI-8izeofa—TCPpowdersOnaettingtimeaofd-TcPbonecements3．2．2．2旺～TCP粒度及浸泡养护时间对骨水泥决凝固性能的影响本实验研究采用三种粒度的n—TCP作为实验原料，考查a—TCP粒度及浸泡养护时间对骨水泥块抗压强度的影响。温度为常温，调和液为0．25MNaH：POJNa：HP0。混合液，[P]，=0．5M。调和固液比为1：0．40。浸泡液为Hank’S溶液。a—TCP粒度及浸泡养护时间对骨水泥块抗压强度的影响见图3．1。从图3．1可看出，o-TCP的粒度越细，骨水泥块抗压强度越高，且骨水泥块抗压强度在浸泡养护到第5天时可达到最大值。日本学者金泽孝文介绍TCP经水化反应能生成HA，且水化时有自凝现象。图3．2为经Hank’S溶液浸泡的样品2在2．OOk倍扫描电镜下观察到的断面形貌(与测抗压强度同步)，揭示了骨水泥在浸泡过程中发生了片状的a1cP晶体的溶解和针状HA晶体的析出。浸泡1天后的样品，SEM照片上可见细微的针状晶体生成，浸泡3天后可见微细的针状晶体包围了原来的晶片，浸泡5天后微细的针状晶体与残余晶片形成了网状结构的整体，从而使骨水泥块具备了较大的抗压强度。网状结构中的大小不均的孔隙有利于BMP的析出和骨组织的长入。 {』】；|JIl大学博L学位论文之芒苫型强出运40—35『30l25：20‘15：10『sl●-●■U一1。⋯。～。一⋯一～024681012t416时间，天图3—1a—TCP粒度及浸泡养护时何对骨水泥块抗压强度的影响Fig．3．1Effectsofo—TOPparticlesiZOandsoakedtim0131compressivestrengthofbonecementsbulk▲卜口一TCP(d50=1．30pm)，02-n-TOP(d50=3，52垫m)。●3-Ⅱ一TcP(d50=6。82pm)a(样品2浸泡1天后)b(样品2浸泡2天后)61 旦查型!壁墼塑墨堑型量堡墨墨垒丝型塑堕窒——C(样品2浸泡5天后)图3．2样品2经Hank’s溶液浸泡后膏；面的SEll照片Fig3-2SEllimaEe8ofsamIe2soakedinHank’sSOIutiona(1day)．b(2days)．O(5days)3．2．2．3Ct-TCP骨水泥硬化过程的显微现察图3．3a，b，C，d，e分别为在600倍光学显微镜下观察到的纯a—TCP(d。=1．30um)骨水泥硬化过程，调和液为为0．25MNaH：Pn／Na，HPO。混合溶液，[P]。=0．5M，固液比为l：0．4。将调和好的糨料均匀地在载波片涂上薄层，滴上Hank’S溶液养护并在显微镜下观察、摄象。图3．3a的水化时间为2分钟，图3．3b的水化时间为5分钟，图3．3c的水化时间为12分钟，图3．3d的水化时间为30分钟。图3．3e的水化时间为40分钟。图3．3a照片显示的为刚开始调和时的情况，d—TCP颗粒还未水化膨胀，成分散状态。图3．3b照片显示颗粒聚集为絮团状，水化产物块开始形成。图3．3d照片显示水化产物块已达N10uIll，骨水泥已有一定强度，表现为初凝。图3．e照片显示水化产物块继续长大。图3．3f显示Ⅱ-TCP骨水泥糊料己由最初的固一液分散体系转变为由搭接的固体块状骨水泥所组成的镶嵌结构的硬化体，对应骨水泥固化的终凝。 婴型-大兰堂土兰堡笙兰eEt(2minute)c(12minutes)b(5minutes)d(30minutes)(40minutes)图33在各种水化时间的a-TCP骨水泥硬化过程显徽照片Fig3-3Miorosraphsofhardenprocessofo—TCPbonecementsateachhydratiofftime 型查型!壁墼塑垒堑型量堡堡堡鱼塑型堕塑垄——3．2．2．4调和液及配料对o【-TCP骨水泥凝结，ling和抗压强度的影响凝结时间和凝结块的抗压强度是磷酸钙骨水泥的最重要性能。很多研究已经报道了缩短磷酸钙骨水泥凝结时间和增加抗压强度的方法。本论文主要研究以。一TCP为主料并添加CaO、磷酸氢钙DCP、和四钙磷酸钙TTCP组成Ca／P=1．5配方组，使用NaH。PO。、Na。HPO。、柠檬酸等为调和液和促凝剂，研究对骨水泥凝结时间和抗压强度的影响。Ⅱ一TCP的中位径d。。为1．301．tm：DCP、TTCP、CaO均为自制，如分别为1．72、2．31和1．2Iam。表3．3N出了粉料成分、调和液、促凝剂对初凝时间、终凝时间及凝结块的抗压强度的影响。从表3．3可看出，在a—TCP类磷酸钙骨水泥主成分的高纯微细a—TCP有很好的水化自凝作用，其水化产物有很高的抗压强度，骨水泥的抗压强度随a-TCP的含量增加而提高。NaH。PO,、Na。ttPO。混合液具有很好的促凝作用，浓度低促凝作用略弱，但固化后强度较高。浓度高促凝作用明显，但固化后强度略低。柠檬酸有很好的促凝作用，但固化体的强度较低。由于CaO迅速水解的产物具有粘接作用，可以明显缩短凝结时间，但加入过多会影响固化块的强度。综合考虑临床上手术的要求及固化强度的要求，采用表3．3中9号配方作为动物实验基本配方，调和液采用0．25MNaH2PO。／Na。HPO,混合液，[P]，=O．5M。3．2．3结果讨论总结以上的研究结果，在本研究实验范围内，制备高纯微细n—TCP骨水泥的较佳工艺路线为：制各TCP前驱体采用将磷酸配成1．43M溶液，自制高纯微细CaCO。(d。=4—5pm)调和成固：液=1：2的浆料。在25"(2下搅拌磷酸溶液，按Ca／P=1．51在反应不冒槽的前提下将料浆在4分钟内快速加入，搅拌10分钟停止反应。综合考虑晶型转变速度及防止高温烧结粒子长大，烧成a—TCP的温度宜控制在1260"C左右，保温时间为l小时，制得的a—TCP较细。调和液为调和液采用0．25MNaH。PO。／Na。HPO。混合液，[P]T=O．5M。固液比为l：0．4。骨水泥配方：采用高纯微细d-TCP(如为1．30ura)；自制高纯微细OCP、CaO(d。分别为1．72和1．2um)为辅配料。摩尔比为：a—TCP：DCP：CaO=0．95：0．025：0．025。 四川大学博士学位论文衰3．3配方、调和液及促凝剂对骨水泥凝结时间和抗压强度的影响TabIe3．3Effectsofformula，litixingIlquidandpromotingsolidificationagentonsettingtimeandCompressivestrengthofbonecementsbuIk—再——i厂衬——1—琵—1渐溅F——～—订嚣——第嚣—、葫甜品分摩时间时问(Mpa，号成分尔比促凝剂(分)浸泡5天)⋯f⋯一一百jir一一⋯一r⋯⋯百碡丽谶瓶7聪ii“～⋯r⋯一1j⋯⋯一丽一r⋯混合液45678d—TCPiⅡ一TCPa—TCPDCPTTCPⅡ一TCPDCPTTCPo—TCPDcPTTCPⅡ一TCPDcPCaOa—TCPDCPCaOⅡ一TCPI)CPCaOlOn—TcP11Ⅱ一TCP10．95：0．033：0．0170．9：0．0670．0330．8：0．134：0．0660．8：0．1：0．10．9：0．05：0．050．95：0．025：0．025Ⅱ-TCPl0．25MNa他PO。／Na：HPO。7350混合液0．45MNa也P04／Na2HPo．52727．0混合液0．25MNaH：PO,／Na。HP0484232混合液0．25MNaHzPo．／Na2HPO,8混合液0．25州a地P04／N叫P0．94926混合液0．25MNaH2PO。／N＆HP0l4混合液2l025HNa如P04／Na羽P0|52327混合液0．25MNmP仉／N删P仉63033混合液0．25MNaH,POJNa．：HPOo4192l混合液(体积占80％)0，25M柠橡酸(体积占20％)o．25酬a扎PO．／N乳HPo．42125混合液(iS积占909b)0．25M柠檬酸(体积占lo％)0．25MNaH。POJNahIPO．62827混合渡(体积占5吨)0．25M柠檬酸(体积 型叁型：壁墼塑至堑型量堡墨墨鱼塑整塑堕鍪——3．2．4本节小结磷酸钙是动物骨骼中无机质的重要组成成分，以磷酸钙为主成分的骨修复材料具有生物相容性好的优点，是一类新型的生物活性材料。磷酸钙骨水泥以其临床手术时方便成型、与自体骨吻合好的优点，更受到人们越来越多的重视。本部分工作是在总结分析前人研究工作的基础上，选择对a—TCP类磷酸钙骨水泥制备工艺及其水化和硬化过程进行系统研究。现将本部分的主要工作总结如下：1．根据TCP前驱体粒度对Q—TCP骨水泥粒度的影响研究，TCP前驱体粒度过细，烧成过程中Q-TCP将发生烧结长大，影响d—TCP骨水泥水化初凝时间、终凝时间和凝固强度。2．n—TCP的粒度越细，骨水泥块强度越高。3．通过改变a—TCP的粒度、配方和调和液组成，可以控制初凝及终凝时间、固化体抗压强度以满足不同外科手术临床的要求。骨水泥配方：采用高纯微细d—TcP(d∞为1．30lIm)；自制高纯微缨DCP、CaO
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