补料发酵法批量培养磁敏感氧化亚铁硫杆菌

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1、中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，３０（６）：１０９?１１２补料发酵法批量培养磁敏感氧化亚铁硫杆菌刘新星郭宁梁万洁张剑（中南大学资源加工与生物工程学院长沙４１００８３）摘要磁敏感氧化亚铁硫杆菌胞内可以生成磁性颗粒，探索其培养条件对趋磁细菌的研究有重要意义。利用补料发酵法，实现了磁敏感氧化亚铁硫杆菌的实验室批量培养。发酵终体积为２Ｌ的摇瓶２＋７发酵条件下，培养４０ｈ后一次补Ｆｅ（５％），使最高菌体浓度达到２．３３×１０个／ｍｌ，比不补料对照提７高了６０．６９％；同样条件

2、下，补入９Ｋ全料则可达到２．４７×１０个／ｍｌ，比不补料对照提高７０．３４％；原子力显微镜磁扫描结果显示发酵得到的菌体有明显磁性，即胞内含有大量磁性颗粒。关键词磁敏感氧化亚铁硫杆菌补料发酵原子力显微镜中图分类号Ｑ９３３３５［１］趋磁细菌指胞内有排列成链状的由类脂物组成保存于中南大学生物冶金教育部重点实验室。本课题的囊泡包裹着纳米级的磁小体，可以沿着地球磁力线组在前期的工作中发现氧化亚铁硫杆菌胞内有磁性颗泳动，在含有铁离子的培养液中生长的一类细菌。但粒，使用能谱分析显示，该磁性颗粒主要由Ｆｅ和Ｏ两［５］

3、是至今发现的多数趋磁细菌都属于微好氧菌、厌氧菌种元素组成。其透射电镜照片如图１所示，图中黑或者兼性厌氧菌，通常都存在于具有严格的垂直化学色电子致密体为磁性颗粒。［２］分层的水环境或底泥中。这种环境在实验室中很难重建，因此，一般趋磁细菌的分离培养非常困难。［３］氧化亚铁硫杆菌是生物冶金中的重要细菌之一，能以亚铁、硫元素以及低价硫化物作为能源，为好氧菌，培养条件相对简单。本课题组在前期的工作中发现氧化亚铁硫杆菌在磁场作用下有微弱的趋磁性，与趋磁细菌很相似，进而在其胞内发现并提取出了磁［４］性颗粒，对磁敏感氧

4、化亚铁硫杆菌培养条件的探索很可能成为趋磁细菌难培养瓶颈的突破口。本文探索了在摇瓶发酵条件下，补料时间、补料浓度和补料方式对磁敏感氧化亚铁硫杆菌生长的影响，以达到高密度培养的目的。１材料与方法图１氧化亚铁硫杆菌透射电镜照片Ｆｉｇ．１Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｏｆｔｈｉｎ１．１材料ｓｅｃｔｉｏｎｅｄＡ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓｃｅｌｌｓ１．１．１菌种氧化亚铁硫杆菌（Ａｃｉｄｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ［６］ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ），从云南东川某酸性矿坑水中分离得到，现１．１．

5、２培养基９Ｋ液体培养基：（ＮＨ）ＳＯ，ＫＣｌ，４２４ＫＨＰＯ，ＭｇＳＯ·７ＨＯ，Ｃａ（ＮＯ），ＦｅＳＯ·７ＨＯ的浓收稿日期：２０１００２０１修回日期：２０１００３１２２４４２３２４２国家“９７３”计划（２００４ＣＢ６１９２０１）、国家自然科学基金度分别为：３．００，０．１０，０．５０，０．５０，０．０１，４４．７ｇ／Ｌ，ｐＨ２．０。（５０７７４１０２）资助项目１．１．３仪器与设备酸式滴定管，生物显微镜，空气电子信箱：ｘｘｌｃｓｕ＠１２６．ｃｏｍ１１０中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈ

6、ｎｏｌｏｇｙＶｏｌ．３０Ｎｏ．６２０１０浴振荡器，ＰＨＳ３Ｃ酸度计，高速离心机１．２方法１．２．１种子液培养取保存菌种接于９０ｍｌ９Ｋ培养基中，接种量１０％，置于２５０ｍｌ锥形瓶，调ｐＨ＝２．０，１８０ｒ／ｍｉｎ摇床培养，３０℃，培养至稳定期，１００００ｒ／ｍｉｎ离心收集菌体，悬浮于ｐＨ２．０稀硫酸备用。１．２．２补料发酵初始培养体积为１Ｌ，培养到一定阶段补料至２Ｌ，补料浓度以ｇ／１００ｍｌ计算。以不补料的２Ｌ培养体系为对照组。从补料开始间隔相同时间取样，在显微镜下用计数板，重复计数３次取平均值，绘制

7、生长曲线，得到最大菌体浓度。发酵条件为磁敏感氧化亚铁硫杆菌的最适生长条件：初始ｐＨ２．５，初始ＦｅＳＯ·７ＨＯ浓度４４．７ｇ／Ｌ和温度３５℃，置于振荡摇４２床１８０ｒ／ｍｉｎ培养。２＋１．２．３亚铁浓度滴定溶液中Ｆｅ离子浓度用重铬酸钾滴定法分析，用二苯胺磺酸钠做指示剂。１．２．４原子力显微镜观察将培养液３０００ｒ／ｍｉｎ离心，取上清，以除去铁钒沉淀。１００００ｒ／ｍｉｎ离心，弃上清，以收集菌体，再用ｐＨ２．０硫酸悬浮，然后重复高速图２不补料对照实验生长曲线和亚铁氧化能力离心和悬浮，直至完全除去胞外的铁钒

8、，制成菌体的无２＋Ｆｉｇ．２ＧｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅａｎｄＦｅｏｘｉｄｉｚｉｎｇ铁悬液。稀释至合适倍数，直接滴在云母片上，自然风ｃａｐａｂｉｌｉｔｙｏｆｃｏｎｔｒｏｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ干，置于原子力显微镜下，用强磁探针扫描，得到菌体（ａ）Ｆｉｎａｌｖｏｌｕｍｅ２Ｌ（ｂ）Ｆｉｎａｌｖｏｌｕｍｅ１Ｌ的形貌图和相图，其中相图表现菌体的磁信号。２＋养液中仍然有大量能源物质Ｆｅ未被氧化利用。但２结果是，摇瓶发酵过程中，溶氧条件很难得到根本改观，因此