狂犬病的实验室检测与诊断技术

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1、狂犬病的实验室检测与诊断技术中国生物技术集团公司武汉生物制品研究所基因工程室严家新徐葛林1.临床诊断与实验室诊断实验室手段对狂犬病的确诊非常必要。ＷＨＯ要求狂犬病病例的统计上报资料要注明诊断的依据（是否包括实验室诊断？）。目前国际上公认狂犬病的死亡率是100%，原则上不承认有狂犬病康复的可能，即狂犬病的发病率应与死亡率相等。没有合格实验室给出的肯定诊断的康复病例应从狂犬病病例的统计数字中剔除。“狂犬病患者必死无疑，不死不算狂犬病”，要挑战这个命题，必须提供确切、完整的病史和权威的实验室诊断资料。2.人狂犬病的生存期内诊断生存期内的诊断技术的选择主要随着病程的不同而异。在病

2、后最初几天，检测抗原一般是敏感的。脑脊液及血清中的病毒中和抗体常常趋向于在病后7—10天出现。检测抗原可用荧光抗体（FA）法检查狂犬病患者角膜印片或皮肤活组织，但是，FA阳性标本在发病的后期更常见。皮肤活组织检查常常从颈背部取含有末稍神经的带有毛囊的标本。角膜印片(切勿划痕)取自伴有脑炎的患者，用显微镜的载波片轻轻触及角膜的中心部位。角膜印片及皮肤活组织标本的质量很重要，采取后应立即冷冻，直至检测。不过，用FA技术做生存期内的诊断，其敏感性是有限的。人狂犬病的生存期内诊断已证实患者及自然感染和实验感染动物的角膜印片中存在狂犬病抗原。但是，角膜印片检出率较低，阳性结果可肯定是

3、狂犬病，而阴性结果并不能排除是狂犬病的可能。虽然在临床症状开始时，在皮肤活组织中可能检出狂犬病抗原，但早期症状时仅有25-50%的患者为阳性，随着病情的进展阳性率也增加。颈背部皮肤活组织检查只有一些患者呈阳性结果，特别是在临床疾病的早期。用FA检查皮肤活组织的灵敏度一般高于检查角膜印片。3.动物和人狂犬病的死后诊断抗原检测病毒分离病毒鉴定等。为了确保实验室结果的可信性，必需满足若干条件：1.标本质量要好；2.标本送达实验室的条件要好（符合GLP标准，　　获得一定级别的资格认证）；3.获得结果的等待时间要短；4.结果的传递要迅速。二　狂犬病诊断实验室的安全措施1.危险性在一般

4、的实验室条件，技术人员暴露于以下传染的危险：——野生狂犬病毒(即街毒)，当实验室对接收到的动物标本进行尸体解剖时或对标本进行加工时(悬液制备，离心)等，这一类操作是非常危险的，必须在P3以上条件的专业实验室中进行。——实验室适应的病毒(即固定毒)，当接种实验动物或操作感染的细胞培养时，特别是制备大量的高浓度病毒时，主要的传染来源为手指被有感染的玻璃或工具刺伤或割破；新糜烂的皮肤或粘膜与感染物接触也应认为是一种传染的危险。虽然固定毒的毒力已大为下降，历史上仅有一例死于固定毒操作的报道，但仍有一定的危险性，因此操作固定毒仍须十分小心。生物安全级别＆对工作人员的要求(Biolog

5、icalSafetyLevel,BSL)(Protection,P)BSL-1：实验人员在实验程序方面受过特殊训练，由受过微生物学或相关科学一般训练的科学工作者监督实验。BSL-2：实验人员均接受过病源处理方面的特殊培训，并由有资格的科学工作者指导。BSL-3：实验人员应在处理致病性的和可能使人致死的病源方面受过专业训练，并由对该病源工作有经验的、有资格的科学工作者监督。BSL-4：实验室成员应在处理特别危险的传染源方面受过特殊和全面的训练，应了解标准和特殊操作中一级和二级遏制的作用、遏制设备、实验室设计性能。实验由在有关病源方面受过训练、并有工作经验的、有资格的科学工作者

6、监督。2.对安全操作的建议操作所有潜在狂犬病感染的材料均应在P2或P3生物安全实验室内进行。对狂犬病实验室诊断的安全性要求：①一个封闭的环境，专作狂犬病感染性工作②通过缓冲更衣间并限制一定的专业人员进入；③穿专用的实验室隔离无菌衣和鞋；④操作完毕对操作台进行消毒(当材料偶然地溢出时应立即用3％的雷苏尔溶液或其他相应的消毒剂消毒)；⑤每日应至少消毒地板一次；⑥所有用后剩余的标本，尸解工具，实验室材料在拿出实验室前应进行高压蒸气消毒。在生物安全柜或隔离器内打开动物颅盖骨的操作很困难，技术人员在操作这项工作时应带面罩，护目镜、手套和围裙。由于与狂犬病相关病毒对人的致病性还不很了解

7、，所有操作可能含有这些病毒的标本均应在生物安全柜内进行。所有实验室工作人员务必进行狂犬病疫苗的暴露前免疫，这些人员的中和抗体应定期检查，所有意外地暴露于感染时必需立即报告负责人。三狂犬病毒抗原的检测1.标本选择在选择、运送标本前，实际操作获得标本的人员与实验室检测人员事先取得联系共同选择实验方法是很重要的。1)标本取自个体的生命期Ａ．检查病毒和(或)抗原：样品应放在干燥试管内。样品的获取可按下述方法进行。(1)用注射器或吸管吸入法采集唾液(不用棉拭)，CSF，皮肤活检等样品。(2)角膜涂片，用显微镜载玻片直接接触角