系统性红斑狼疮模型小鼠脾脏细胞凋亡及可能机制

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1、系统性红斑狼疮模型小鼠脾脏细胞凋亡及可能机制作者：唐小云,李霞,鞠宝玲,张晓莉,吕昌龙【摘要】　　目的:研究系统性红斑狼疮（SLE）模型小鼠的脾脏细胞凋亡及其相关调控机制。方法:采用ConA活化的同系脾脏细胞诱导BALB/c小鼠SLE,通过检测其外周血自身抗体、肾组织病理学改变确定SLE小鼠模型诱导成功。脾脏细胞凋亡的检测采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记法,免疫细胞化学法检测脾脏细胞Bcl2和NFκB的表达。结果:ConA活化的同系脾脏细胞成功诱导BALB/c小鼠发生SLE,与盐水对照组和未活化脾脏细胞组比较,SLE模型小鼠脾脏细胞凋亡率明显降低

2、,Bcl2和NFκB的表达均增加（P<0.01）。结论:SLE模型小鼠脾脏细胞凋亡率降低,可能是通过Bcl2和NFκB的表达增加所致。【关键词】系统性红斑狼疮细胞凋亡Bcl2NFκB　　系统性红斑狼疮（systemiclupuserythematosus,SLE）患者体内产生多种自身抗体,核小体是主要的抗原,核小体通常存在细胞核内,体内完整的核小体抗原是由细胞凋亡DNA断裂产生的。研究表明,SLE患者存在细胞凋亡紊乱,11细胞凋亡过度[1]或凋亡过低[2]都可导致SLE的发生。机体免疫细胞的凋亡紊乱可能是细胞内凋亡相关基因异常表达的结果,如Bcl

3、2和NFκB。因此,本研究采用ConA活化的同系脾脏细胞免疫BALB/c小鼠诱导SLE的发生,同时检测其脾脏细胞凋亡及Bcl2和NFκB表达的改变以明确细胞凋亡紊乱是否是这一SLE模型小鼠发病的始动因素,检测凋亡调控因子的改变以揭示SLE发病机制,为临床治疗SLE提供理论和实验依据。　　1材料和方法　　1.1材料BALB/c近交系小鼠(雌性,7～8周龄,体质量18～22g,清洁级),购自哈尔滨医科大学附属二院实验动物中心。动物合格证号:SCXK（黑）20020002。刀豆蛋白A(ConA)为Sigma公司产品。RPMI1640培养基为Gibco公司产品

4、。FITC标记的山羊抗小鼠IgG为SantaCruz公司产品。抗核抗体（antinuclearantibody,ANA）和抗组蛋白抗体（antihistoneantibody,AHA）（H2AH2B）ELISA试剂盒为美国BPB生物医学有限公司产品。末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记（terminaldeoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling,TUNEL）试剂盒购自美国Promega公司。兔抗Bcl2和小鼠抗NFκB一抗为SantaCruz公司产品。兔二步法和小鼠二步法检测试剂盒为北京中杉金桥

5、生物技术有限公司产品。　　1.2方法11　　1.2.1ConA活化的脾脏细胞的制备无菌取脾脏制备脾脏细胞悬液,用含100mL/L胎牛血清的RPMI1640调整脾脏细胞密度为2×109/L,加入ConA,使其终浓度为0.005g/L。然后置37℃、50mL/LCO2培养箱内孵育3d,收集脾脏细胞悬液,并用生理盐水调整脾脏细胞密度为2×1011/L备用。同时制备未添加ConA的脾脏细胞作对照[3]。　　1.2.2动物分组及BALB/c小鼠SLE模型的诱导(1)SLE模型诱导组（MI组）:取活化的脾脏细胞5×107/只（大约0.2～0.3mL）分皮下几点注射。每周1

6、次,连续3次,第4周开始进行相应检测。(2)脾脏细胞对照组（CC组）:给正常小鼠在相同时间、相同部位注射同等剂量的未经活化的同系脾脏细胞悬液。(3)生理盐水对照（NC组）:给正常小鼠在相同时间、相同部位注射相同体积的生理盐水[3]。　　1.2.3SLE模型鼠的鉴定(1)样本收集:于实验第4周摘除眼球采血析出血清待测,留取肾脏标本进行病理学检测。(2)SLE模型鼠外周血中ANA、AHA水平的测定:采用ELISA法检测,具体步骤按试剂盒说明进行。(3)肾脏病理学检测:进行光学显微镜、荧光显微镜和电子显微镜检查。①光学显微镜观察:常规石蜡切片,HE染色,用中性树脂封

7、固,光学显微镜下观察肾脏炎性改变。②荧光显微镜观察:采用直接免疫荧光法,简述如下:取出冻存于-70℃冰箱中的小鼠肾脏,11OCT包埋,5μm切片,滴加FITC标记的羊抗小鼠IgG抗体（1∶100稀释）于组织切片上,置37℃孵育30min,PBS液冲洗,缓冲甘油封片,在荧光显微镜下观察肾小球内有无IgG沉积及分布部位。③电子显微镜观察:肾脏经30g/L戊二醛前固定、锇酸后固定、环氧树脂812包埋、超薄切片、电子染色后,透射电镜观察肾小球基底膜、足突的变化及有无电子致密物沉积。　　1.2.4SLE模型鼠脾脏细胞凋亡的检测于实验第4、6、8、10周,无菌取小鼠脾脏,

8、制备脾脏细胞悬液,涂片。采用TUNEL