转人铜锌超氧化物歧化酶基因马铃薯的研究

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1、华东理工大学博士学位论文第I页转人铜锌超氧化物歧化酶(h-Cu/Zn-SOD)基因马铃，的研究摘要采用RT-PCR技术从人肝总RNA中分离扩增了490bp的人铜锌超氧化物歧化酶(h-Cu/Zn-SOD)基因的cDNA序列，进行了序列测定，结果和文献报道的一致;构建了CaMV35S启动子驱动h-Cu/Zn-SOD基因的植物表达载体PBIC,uSOD:用三亲交配法将重组质粒PBICuSOD转化到农杆菌LBA4404，转化马铃薯得到转基因植株。PCR和Southern-blot分析证明，h-Cu/Zn-SOD基因已整合到马铃薯基

2、因组中。Westernblot分析表明，h-Cu/Zn-SOD荃因在转基因马铃薯植株中得到表达。用NBT光还原法测定转基因马铃薯植株中的SOD酶活力，叶中SOD的酶活力为1066.6U/g.PW(湿重)，块茎中SOD的酶活力为1011U/g.FW<以转人Cu,Zn-SOD基因马铃薯为材料，研究了在不同NaCI浓度胁迫下其活性氧代谢及保护酶活性的变化。结果表明:在NaCl胁迫下转基因马铃薯植株体内的超氧化物阴离子(Oz')产生速率明显低于对照非转基因马铃薯，超氧化物歧化酶(SOD)活性转基因马铃薯显著高于对照，过氧化氢酶(C

3、AT)及抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性转基因马铃薯高于对照;转基因马铃薯体内的脂质过氧化产物一丙二醛(NDA)含量显著低于对照·以转人Cu,Zn-SOD基因马铃薯为材料，研究了在低温胁迫下其活性氧代谢及保护酶活性的变化。结果表明:在低温胁迫下转基因马铃薯植株体内的超氧阴离子(Oz')产生速率明显低于对照非转基因马铃薯:超氧化物歧化酶(SOD)活性转基因马铃薯显著高于对照，过署氧化氢酶(CAT)及抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性转基因马铃薯略高于对照:转基因笋体内的脂质过氧化产物一丙二醛MA)含量显著低于对照利用克隆的人铜

4、锌超氧化物歧化酶(h-Cu/Zn-SOD)基因，构建了马铃薯块茎特异性子驱动h-Cu/Zn-SOD基因的植物表达载体PPSCuSOD:用三亲交配法将重组质粒pPSCuSOD转化到农杆菌LBA4404，转化马铃薯得到了转基因植株。PCR和PCR-Southern分析证明，h-Cu/Zn-SOD基因己整合到马铃薯基因组中。Westernblot分析表明，h-Cu/Zn-SOD基因在转荃因马铃薯植株的块茎中得到表达。用NBT光还原法测定转基因马铃薯块茎中的SOD酶活力为1920U/g.FW,对在转h-Cu/Zn-SOD基因马铃薯

5、块茎中特异性表达的SOD进行了分离纯化并研究了其性质。经硫酸铰沉淀、SephadexG-100凝胶过滤和DEAE-52层析，转基因马铃薯的h-SOD被纯化到均一程度。从200g转基因马铃薯块茎中纯化得到15.2mg酶，酶比活力达3595U/mg蛋白;SDS-PAGE法测得其亚基分子量为18801u;该酶对KCN202都敏感，热稳定性较强，紫外光区吸收值在260nm，表明该酶纯化的h-Cu/Zn-SOD.关键词h-Cu/Zn-SOD:转基因马铃薯:保护酶活性:活性氧代谢:纯化第11页华东理工大学博士学位论文Expressio

6、nofTheHumanCopper,Zinc-SuperoxideDismutaseGeneinPotato(SolanumTuberosum)AbstractThecDNAencodinghumanCu/ZnsuperoxidedismutmewasamplifiedbyRT-PCRusingthetotalRNAofhumanliverasthetemplate,andwasclonedintotheplasmidpBluescriptSK.Thesequenceoftheclonedh-SODcDNAwasconsi

7、stentwiththereporteddate.Theh-SODcDNAwasclonedintoplantexpressionvectorPBlCuSunderthecontroloftheCaMV3SSpromoter.TherecombinantplasmidPBlCuSwasintroducedintoAgrobacteriumtumefaciensLBA4404,PotatoplantsweretransformedviaAgrobacteriumtumefaciensmediatedprocedure.Tra

8、nsgenicplantswereconfirmedbyPCRandsouthern-blotanalysis.ThehumanCu,Zn-SODgenewasexpressedinpotatoathighlevel.TheexpressionproductwascharacterizedbySDS-P