酸菜发酵剂的制备及酸菜风味成分分析

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分类号：TS255密级：(秘密、机密、绝密)学校代码：10057研究生学号：08841003酸菜发酵剂的制备及酸菜风味成分分析SuanCaiStarterCulturePreparationandItsFlavourComponentsAnalysis专业名称：生物化学与分子生物学指导教师姓名：王艳萍教授研究生姓名：栾天奇申请学位级别：理学硕士论文提交日期：2011年1月论文课题来源：科技部十一五支撑计划学位授予单位：天津科技大学 天津科技大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究工作所取得的成果。除文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包括任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果内容，也不包括为获得天津科技大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。对本文研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：钚么匆＼一，日期：_，『『年歹月I乒同知识产权和专利权保护声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师具体指导下并得到相关研究经费支持下完成的，其数据和研究成果归属于导师和作者本人，知识产权单位属天津科技大学；所涉及的创造性发明的专利权及使用权完全归天津科技大学所有。本人保证毕业后，以本论文数据和资料发表论文或使用论文工作成果时署名第一单位仍然为天津科技大学。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：臻丢焉日期：伊ff年弓月f乒同学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，同意公布论文的全部或部分内容，允许论文被查阅和借阅。本人授权天津科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密Il(请在方框内打“、／”)，在年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密lV(请在方框内打“√”)。作者签名：弧i南日期：钞l／年岁月眵日导师签名：可彩牟日期：≯，，年夕月膨日 摘要酸菜是我国传统发酵食品，本研究以工业化生产酸菜为需求，研究酸菜发酵条件，制备活菌浓度高，产酸速度快，适应酸菜发酵环境的酸菜乳酸菌发酵剂。本试验对自然发酵酸菜乳酸菌进行了分离与鉴定，选取优良菌种作为人工接种发酵剂，并对酸菜发酵条件进行优化，最后利用响应面法优化酸菜乳酸菌发酵保护剂配方。主要结果如下：1．通过菌落形态和显微形态观察及生理生化试验从14种来源的酸菜中共分得48株乳酸菌，经形态学鉴定，其中球菌3株，杆菌45株；对其中的9株典型乳酸菌进行PCR．DGGE法分析，其中7株为植物乳杆菌。2．通过单因素试验及正交试验，以感官评分法为依据，对人工接种酸菜进行发酵条件优化，得到感官评分最高的三个样品：样品4、5、7。确定最佳发酵条件为：接种量8％，菜水比为1：1，菌种比例为肠膜明串珠菌：植物乳杆菌：干酪乳杆菌为2：1：1，菌种原始培养基为脱脂乳，盐度1％(相对于菜重)，18～20℃下发酵时间为60天。3．通过对酸菜风味物质进行HPLC分析，有机酸分析结果表明三个样品与自然发酵酸菜中的有机酸种类和含量并无明显差异，但样品4中的草酸含量最少；同时样品4中的乳酸、柠檬酸、富马酸和琥珀酸的含量都是三个样品中最高的，并且，琥珀酸含量与自然发酵酸菜中的含量相当，具有较高的鲜味，与其最高感官评价得分相一致。4．对样品4进行SPME．GC．MS挥发性风味物质检测中，结果表明，乳酸菌接种发酵酸菜风味成分与自然发酵酸菜相似，人工接种发酵酸菜中含有几乎全部传统酸菜中的特征风味物质。5．利用响应面法对乳酸菌发酵保护剂进行优化，确定最佳保护剂配方为优化后的保护剂配方为：脱脂乳添加量为10％、海藻糖1．6％，甘油O．6％，山梨醇2％，麦芽糊精】％。以此配方对四株乳酸菌进行了验证试验，优化后的保护剂对四种乳酸菌都有较好的保护效果，有实际应用价值。关键词：酸菜；乳酸菌；发酵条件；风味物质；发酵剂 ABSTRACTSuanCaiisourcountry’Straditionalfermentedfood．ThisstudywascarriedoutfromtheperspectiveoftheindustrializedproductionofSuanCai．Inthisthesisthelacticacidbacteria(LAB)innaturalfermentedSuanCaiwereisolatedandidentified．andtheinoculatedfermentationconditionswereoptimized，andthefreeze—dryingmediaofSuanCaistarterculturewasobtainedusingResponseSurfaceMethodology(RSM)．Theconclusionswereasfollows：1．48strainsofLA．Bwereisolatedfrom14kindsofdifferentnaturalfermentedSuanCaiusingmorphology,Physiologyandbiochemistrymethods．3Lactococcusand45Lactobacillus．ThePCR-DGGEanalysisofthe9typicalstrainsshowed7ofthemwasLactobacillusplantarum．2．TwosinglefactorexperimentsandoneorthogonalexperimentweredesignedtooptimizeinoculatedSuanCaifermentationconditionsbasedonsensoryevaluation．3bestsamples：Sample4，5and7wereobtainedforthesubsequenttests．Theoptimumfermentationconditionswere：inoculumsize8％，stuffandwaterratioiS1：1，thestrainsratiowas：Leuconostocmesenteroides：Lactobacillusplantarum：Lactobacilluscasei2：1：1．starterculturemediaisskimmilk，salinity1％(tothestuff)，temperature25。Candfermentationperiodis2months．3．HPLCwasusedtoinvestigateorganicacidin3samplesandthecontrolSuanCai．Theresultsindicatedthattherewasnodistinctionincomponentandcontentoforganicacidbetween3samplesandthenaturalproduct，whereasoxalicacidinsample4waslowerthantheotherswhileotherorganicacidswerehigher,andthesuccinicacidwasasthesameasthenaturalproduct．Theconclusionwascoincidentwiththesensoryevaluationresults．4．Thesample4'svolatilitycomponentswasanalyzedusingSPME—GC—MS．Thecomponentsinsample4weresimilartothenaturalproduct，containedalmostallcharacteristicflavorsubstancesoftraditionalSuanCai，butfeweramountsofvolatilitycompoundsweredetectedinLABinoculatedSuanCai．5．Thefreeze—dryingprotectantofSuanCaistarterculturewasobtainedusingResponseSurfaceMethodology．Theoptimizedmediaincludes：trehalose1．67％，glycerol0．57％，sorbitol2％，maltodextrin1％andskimmilk10．7％．Keywords：SuanCai，LAB，Fermentationconditions，Flavorcompounds，Starterculture 目录l前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．1研究背景⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．1．1酸菜的起源与发展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．1．2酸菜的种类及其制作工艺⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．1．3酸菜的生理功能⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．21．2酸菜发酵中的乳酸菌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．31．2．1酸菜发酵机理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31．2．2酸菜中乳酸菌菌相变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯41．2．3发酵蔬菜中乳酸菌的作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51．3酸菜中风味物质的研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．61．3．1酸菜风味物质的来源⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61．3．2风味物质的分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯81．4酸菜发酵剂的研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1l1．4．1国内市场酸菜概况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯111．4．2纯菌种发酵酸菜的研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．121．4．3直投式乳酸发酵剂的研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．121．5本课题研究目的及意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯131．5．1研究目的⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．131．5．2研究意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一141．5．3论文主要研究内容⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一142材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯162．1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯162．1．1酸菜样品⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一162．1．2试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．162．1．3仪器与设备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯～172．1．4主要溶液的配制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一182．1．5培养基⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．192．2试验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯20771．1酸菜中乳酸菌的分离纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一202．2．2PCR—DGGE法分析酸菜菌相⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一202．2．3乳酸菌发酵酸菜条件优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一222．2．4感官评价⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一232．2．5质构分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一232．2．6理化指标的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一23 2．2．7有机酸分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一242．2．8挥发性风味成分的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．242．2．9乳酸菌冷冻干燥保护剂的优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．252．2．10统计分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯253结果与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯263．1酸菜菌相分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯263．1．1酸菜细菌基因组DNA的提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯263．1．2PCR扩增⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一263．1．3酸菜菌相的DGGE分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．273．2酸菜中乳酸菌的分离⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯283．2．1酸菜乳酸菌的分离纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一283．2．2乳酸菌的PCR．DGGE分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3l3．3酸菜发酵菌种、时间的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯：⋯⋯⋯⋯⋯⋯323．3．1酸菜发酵菌种的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一323．3．2酸菜发酵时间的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一333．4酸菜发酵条件优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯333．4．1酸菜发酵过程中pH变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯333．4．2接种酸菜发酵条件正交试验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一343．4．3理化及风味指标的检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一363．5发酵剂的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯423．5．1菌活多元二次模型方程的建立与检验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一423．5．2菌活响应面交互作用与优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一443．5．3验证试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．454结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．465展望⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯486参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯497攻读硕士学位期问发表论文情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯558致{射⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．56附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．57 天津科技人学硕二fj学位论文1前言1．1研究背景1．1．1酸菜的起源与发展酸菜是腌渍菜的一种，具有独特而悠久的历史。我国最早利用蔬菜发酵法制作酸菜的历史可追溯到周朝。北魏贾思勰在我国著名的农业科学著作《齐民要术》中，更是详细介绍了我们的祖先用白菜等原料腌渍酸菜的多种方法。唐代高僧鉴真和尚在成功东渡日本时，将我国的腌渍菜的制作方法传入日本。腌渍菜传入韩国发生在1300年前的韩朝半岛三国时代，并在随后与当地民族饮食文化相结合，发展形成了现在著名的韩国泡菜。欧洲蔬菜的腌制的历史则可以追溯到公元1世纪，Plinius⋯当时首次对如何用白菜、小黄瓜制成酸泡菜腌制品进行了描述。在漫长的历史变迁中，酸菜在其制作工艺和品种上都有了很大发展，出现了许多具有地方特色的传统名特优制品，如云南大头菜‘21、萧山萝卜干【31、湖南的盐渍蓖头H1、湘西酸豆角【51以及浙江臭冬瓜【6】等；国外比较有名的发酵蔬菜有同本泡菜(Senmaizuke)171、西班牙的发酵油橄榄【8】、韩国的泡菜(Kimchi)191等。2002年韩国国内泡菜市场产值约为20亿美元，出口总额达8646万美元，现在韩国泡菜出口额『F以每年10％的速度增长110】。日本依靠中国和美国等蔬菜输出国进口生鲜蔬菜和腌制半成品使其泡菜产量不断上升，从1996年的108万吨攀升到了2002年的118力．吨，总生产额为36亿美元【11,12J。2000年全球腌制蔬菜贸易总额约为13亿美元，在国际市场上日韩两国占据了95％以上的份额【l31。2000年，中国酸泡菜工业的市场销售额约为10亿元，中国酸泡菜的代表之一一四川泡菜，其企业出口总额约500力．美元，仅占国际泡菜市场总量的3％[i41。在发展工业化生产泡菜的同时，韩国的一些大学和许多私人机构也丌展了泡菜制作及其风味和营养的研究。美国、日本在酸泡菜菌种的鉴定、利用及营养成分保存方面的研究也较多。我国也有部分关于酸菜制作、风味营养物质、菌种选择、安全性控制等各个方面的研究，但研究仍相对较少。东：f匕酸菜是我国酸菜的典型，其特点是清酸而脆爽，色泽鲜亮，香气扑鼻，玎胃提神，醒酒去腻，不但能增进食欲、帮助消化，还可以促进人体对铁元素的吸收。随着人民生活水平的提高和交通运输的便利，不仅东北地区，越来越多的人丌始接触并喜欢上了这种健康、天然的食品。但目自订，酸菜的生产依然是传统发酵方法，发酵过程中容易污染，产品质量不稳定，生产效率低下。因此，有必要对酸菜发酵做基础性的研究。1．1．2酸菜的种类及其制作工艺酸菜的制作是一种利用食盐的高渗透压作用以乳酸菌发酵为主，兼有蛋白质分解的微生物发酵过程的冷加工方法，对蔬菜的营养成分、色香味体的保存有利。它以各 l前言种蔬菜为基本原料，其风味特点及营养价值均与蔬菜的化学成分和制作过程中的变化有关。酸菜在我国分布广泛，不同地域有不同的叫法，人们最熟悉的酸菜有东北酸菜，也叫酸白菜；东北有名的家常菜酸菜炖排骨、酸菜白肉等就是用的这种酸白菜，这种酸菜是以大白菜为原料直接在低盐浓度下发酵而成，一般冬天要自然发酵一个月左右才成熟；在西南地区的酸菜，称为川味酸菜或四川泡菜，在川渝两地广为流传，近些年在全国各地也普遍流行。著名的菜肴有四川的酸菜鱼和酸菜牛肉等。西南酸菜与东北酸菜的区别一是原料菜的不同，而是制作方法不同。西南酸菜是“泡”的，讲究的是“老盐水”的制作。原料选用的是当地的一种青菜。“老盐水"的制作方法是将原料菜先洗净晾干，放入坛子中压实，在放入大量的粗盐，用水密封住坛子腌5～7天，取出青菜挤出汁液，留住盐水。如此反复3～5次，每次都只留盐水，直到盐水量在半坛左右时为止。然后把盐渍青菜用盐水清洗后入坛，在坛中添加适量香料，如八角、桂皮、茴香、花椒等，再用“老盐水”泡制几天即成。也有在泡制的时候加入干辣椒、姜、蒜、糖和白酒的，为的是帮助发酵和让泡菜的口感更丰富。这种泡菜的口味特点是质地脆爽并有一种复合香料的香气。还有一种比较有名的是广东潮州的酸菜和台湾地区的覆菜(福菜)做法基本一样，同属于客家菜。这种酸菜的原料是采用当地的芥菜或芥菜的变种菜，这种酸菜在腌渍过程中不需加水，是直接用盐腌的，而且加盐量比较大，一般要加菜量的9％～10％左右。并且中问需要进过一道揉压工序，为了使盐充分浸渍到菜中，一般要揉压3次，直至把芥菜中的菜汁全部挤出。揉压好的菜还需要再加入1％的食盐，然后才可以盖盖封口，让其自然发酵直至成熟。这种酸菜的特点是色泽鲜黄，菜身稍扁，味道成酸适口。1．1．3酸菜的生理功能酸菜的主要原料是营养丰富的各种蔬菜，因此水分、碳水化合物、维生素、钙、铁、磷等矿物质含量相当丰富。酸菜富含乳酸，一般为O．4％～1．4％，成酸适度，味美而嫩脆，不仅能增进食欲，而且能帮助消化，具有一定的医疗功效，是具有多种调节作用的保健食品。(1)净肠和抗菌作用：酸菜中的乳酸菌含量很高，达107～109cfu／mL。乳酸菌是参与调节人体肠道微生态平衡的主要菌系。酸菜中的乳酸菌菌体及其代谢产生的有机酸和维生素对人体具有多种保健功能，可促进胃肠道蠕动，帮助消化，防止便秘等。乳酸菌产生的有机酸对食品中微生物也具有较好的抑制作用。Chang—HoonKangI”I等将6科t肠致病菌接种到大白菜中发酵，当pH3．9时，已检不出大肠杆菌，当pH3．7时，梭菌属、埃希式菌、沙门菌属和葡萄状球菌均未被检出。同时，乳酸菌产生的乳酸链球菌素(Nisin)对革兰阳性菌具有广谱的抑制作用，目前作为天然防腐剂已在许多国家和地区使用。(2)抗突变活性和预防脑溢血：Park．Ky116]研究发现，酸菜在Ames试验和SOS显色试验中均显示出显著的抗突变活性。HeuiDongParkI"j等从酸菜中分离出来的植 天津科技火学硕?I：学位论文物乳杆菌具有较强的抗突变活性。(3)抗癌效果：酸菜中丰富的Vc能起抗癌作用。Woon．YougChoi[博J等用甲醇提取发酵6天后的卷心菜，将提取物用来喂养患有AGS．胃癌细胞的老鼠，结果60．7％的胃癌细胞的生长受到抑制，并减少了癌细胞的生成，延长了试验组老鼠的寿命。Keun．OkJung[19】等将发酵的韭菜汁经二氯甲烷蒸馏后用来研究它对人类胃腺癌和结肠癌的治疗效果：服用0．1mg／mL提取物4周后，能将AGS．胃腺癌和HT-结肠癌细胞的存活率分别降低到19％年I37％。(4)抗动脉硬化和抗肥胖作用：酸菜属于高纤维、低热量食品，有助于消化，可减少脂肪累积，具有减肥作用，这一点已在动物试验中得到证实。日本京都大学对人体做的试验结果也显示，酸菜有减肥的特效。(5)抗衰老作用：Jong．HyenKiIIl【20】等研究了酸菜对小鼠大脑中抗氧化酶活性和自由基产生的影响，研究表明，酸菜有延缓衰老的作用。1．2酸菜发酵中的乳酸菌发酵蔬菜有泡制、腌制、酱制等不同的加工方法，不同加工方式其微生物的发酵活动程度不同【2l】。乳酸菌作为蔬菜发酵过程中的主导，目前已经成为各国学者的研究焦点，这些研究为发酵蔬菜加工工艺的改善提供了理论基础。1．2．1酸菜发酵机理蔬菜发酵的基本原理是利用食盐的防腐作用、微生物的发酵作用、蛋白质的水解作用以及其他一系列的生物化学作用，利用乳酸菌生长赋予产品的风味，利用乳酸菌生长过程中的产酸特性及产生活性代谢产物特性，抑制有害微生物的活动，从而使产品得以长时间保存，并具有独特的色泽、香气与味道。(1)食盐的保藏作用食盐是发酵蔬菜的一个重要原料，在蔬菜发酵过程中起着非常重要的作用。首先，食盐溶液在腌制过程中与微生物原生质层构成渗透系统，当食盐浓度大于微生物原生质层的离子浓度，即微生物细胞内渗透压低于外界环境时，其细胞就会渗透失水，发质壁分离，代谢受到抑制而停止生长甚至死亡【22】；其次，食盐对于微生物还有毒害作用，一般的，食盐溶液中常会有Na+、K+、Ca2+和M92+等离子，当它们的浓度较高时就会对微生物产生毒害作用f22J；另外，食盐可以降低腌制品的水分活性，食豁溶液中的各种离子与水发生水和作用，减少了溶液中的游离水，从而使有害微生物的活动受到抑制1221；最后，微生物体内各种酶的活性在食盐溶液中也会遭受刁i同程度破坏，尤其是氧化酶类，其活性会随着食盐浓度的提高而下降，从而有助于提高发酵蔬菜产品的保藏性能。f2)微生物的发酵作用蔬菜的发酵由天然附着在蔬菜和其他辅料表面的微生物活动所引起，这些微生物包括乳酸菌、酵母菌、霉菌、醋酸菌等。在蔬菜的发酵过程中，各种微生物的活动引起一系列复杂的生化反应，其中起主导作用的是乳酸发酵，酒精发酵次之，醋酸发酵 l前高最少。这些发酵代谢产物赋予产品鲜甜、微酸、醇厚的独特风味。发酵作用中最为主要的乳酸发酵，可分为3个阶段，即以异型乳酸发酵为主的初期阶段，以同型乳酸发酵为主并积累乳酸的中期阶段和乳酸发酵结束、产品风味形成的后期阶段。在初始发酵阶段，参与发酵的乳酸菌主要包括双歧杆菌、明串珠菌和部分乳杆菌(短乳杆菌、发酵乳杆菌等)，此外还有一些酵母也参与这一阶段的发酵。由于新鲜蔬菜上占优势的微生物是革兰氏阴性好氧菌和酵母菌，而生产初期，乳酸菌的数量较少【2引，因此，各种有害微生物活动和异型乳酸发酵在此最初阶段同时进行，随着氧气的消耗、乳酸及C02的积累，有害微生物的活动受到抑制。最初数量最多的是肠膜明串珠菌12引，这是由于其传代周期相对较短，生长繁殖速度快。异型乳酸菌产酸量少，对酸敏感，其发酵机理与产物较为复杂，发酵途径为磷酸解酮酶途径，有多种代谢产物，包括乳酸、醋酸、乙醇和C02，其中，发酵产生的C02可以降低环境中02的含量，不但抑制了好氧微生物的生长，而且可以刺激厌氧乳酸菌的生长。肠膜明串珠菌可利用多余的糖类生成甘露醇和葡聚糖，这两种物质没有游离醛基或酮基，无法与氨基酸完成褐变反应125|。随着发酵的进行，乳酸不断积累，耐酸性差的异型发酵乳酸菌生长受到抑制，其优势地位被一些耐酸性更强的同型发酵乳酸菌取代。蔬菜发酵中常见的同型乳酸发酵微生物有德氏乳杆菌、植物乳杆菌、戊糖片球菌和乳链球菌等，它们所进行的同型乳酸发酵是蔬菜发酵的主要形式。同型发酵乳酸菌代谢遵循糖酵解(EMP)途径，代谢产物为乳酸。原料中80％以上葡萄糖几乎都可以被这些乳酸菌利用，将其转化为乳酸。同型发酵乳酸菌产酸能力强，并可产生像细菌素这样的抑菌物质，从而抑制了杂菌的活动。在发酵末期，由于同型发酵的植物乳杆菌其较强的耐酸性而成为优势菌，并完成发酵。(3)蛋白质分解作用蔬菜中含有一定量的蛋白质和氨基酸，一般蔬菜含蛋白质0．6～0．9％。在发酵过程中，由于微生物和蔬菜本身所含蛋白水解酶的共同作用，蔬菜中的蛋白质被分解为氨基酸，是其色、香、味的主要来源【26l。1．2．2酸菜中乳酸菌菌相变化国内外学者对各种发酵蔬菜中的乳酸菌进行了大量研究。如，顾振宇等127．28I从海宁半二F腌制芥菜中共分离到参与发酵的菌种，包括乳酸片球菌、肠膜状明串珠菌、发酵乳柙：菌、植物乳杆菌和短乳朴菌。汤水平等|28J对盐渍蓖头发酵过程t．fI刁i同时期的乳酸菌进行了分离。Lee等人【2圳从韩国泡菜(kimchi)Fp分离得到的乳酸菌经鉴定分别为Leuconostocmes．、Lactobacillusc．wvaltts、Lactobacillussake、短乳杆菌和植物乳_卡l：菌。Tamang等人IjuJ从印度传统发酵蔬菜sinki、khalpi和gundruk中分离得到了65株乳酸菌，并使用分子生物学手段进行了鉴定。Pedersonlll在1930年研究了泡卷心菜中的微生物，第一次指出了肠膜明串珠菌启动泡菜发酵。Alburyl3lJ等在1953年研究了酸黄瓜自然发酵的微生物变化规律：泡菜发酵的早期由肠膜明串珠菌启动的异型发酵阶段 天津科技人学坝，I!学位论文}，+优势，随着产酸量的增加，肠膜明串珠菌的活动受到抑制以致死亡，此时啤酒片球菌、短乳杆菌、植物乳杆菌等占优势，最终由同型发酵的植物乳杆菌完成发酵的全过程。李书华，陈封政1321等1981年研究了明串珠菌、片球菌、短乳杆菌、植物乳杆菌在白菜汁中的联合生长规律：明串珠菌的活动受到其他几种菌的抑制，而短乳杆菌和植物乳杆菌的生长则受到这几种菌的促进作用。Harris【33】等在1992年从酸菜中分离出两株能产生乳酸链球菌肽的乳酸链球菌，并对其生理特点进行了研究。在我国，蔬菜发酵微生物学起始于20世纪40年代，赵学慧【341对泡菜发酵过程中的微生物学性质进行了较深入的研究：泡菜在发酵过程中有酵母、霉菌、细菌多种微生物参与，其中主要的产酸菌是乳酸菌。钟之绚135j分析了酸白菜在不同发酵过程中乳酸菌种类及其变化规律。毕金峰【36J等对酸泡菜发酵过程中乳酸菌区系进行了分离鉴定，并研究了典型菌株的发酵生理特性。赵文红137J等对自然发酵泡菜中的乳酸菌进行了分离及特性研究：发酵初期明串珠菌属占优势，生长产酸，随着酸度的增加，明串珠菌属停止生长并死亡，而乳杆菌属迅速繁殖，成为优势菌。1．2．3发酵蔬菜中乳酸菌的作用(1)改善蔬菜制品的风味乳酸菌在蔬菜发酵的过程中，通过同型或异型发酵，利用糖类产生乳酸、醋酸、丙酸等有机酸，赋予发酵蔬菜制品丰富而柔和的酸味。发酵过程中还产生了酮类，它可赋予产品清香、爽口、圆润口感。产生的低级饱和脂肪酸与脂肪醇形成的酯类具有水果香味，有机酸与醇类结合生成的酯类还具有清新的花果香味。乳酸发酵蔬菜制品不仅在保持蔬菜原料原有鲜、香、脆、嫩风味的基础上，增加了有乳酸发酵的香味，而且减少了原料中原有的刺激性或不良风味。如周相玲【38J对卷心菜及其发酵制品风味物质进行检测，发现经过发酵，卷心菜中原有的具刺激性气味的异硫氰酸酯类含量从63．5％下降至0．04％，且风味物质的组成更为复杂。(2)提高蔬菜制品的营养价值和保健作用由于乳酸菌没有分解纤维素和蛋白质的酶系统，因此它们不能破坏植物细胞组织而只能以原料中可溶性物质作为生长代谢的碳源，通过其代谢产生多种有机酸、维生素和酶，提高了蔬菜制品的营养价值。发酵后产生乳酸可以提高蔬菜中钙、磷、铁的吸收利用率，促进铁和维生素D的吸收【39|。乳酸菌发酵还可降低植酸的含量，促进钙、锌等微量元素的吸收利用。另外有研究表明，每升乳酸菌培养基内胞外B族维生素含量为：VBl125-250lag、VB210gg、VB6100Pg、VBl20．6lag、叶酸25斗g、烟酸；．：皑。在安全性方面，一些乳酸菌还具有降解酵蔬菜中亚硝酸盐作用，从而使食用发酵蔬菜更为安全⋯J。乳酸菌作为蔬菜发酵过程中的主导菌群，不仅可以提高产品的营养价值，改善风味，近年来的研究表明，乳酸菌还有很多特殊医疗保健作用：改善胃肠功能，抗肿瘤，增强免疫，降低胆固醇，改善泌尿生殖系统，抗辐射，美容，长寿，降血糖，防治龋 I前高齿等。Park等人|41421研究发现，从韩国泡菜中分离出来的植物乳杆菌KLAB21具有较强的抗突变活性。Barbara等人143J对欧洲泡菜汁的研究发现发酵增强了白菜的抗氧化性能，大蒜的抗氧化能力经过发酵也有所提高。Choi等【441发现泡菜中的辣椒可以显著减轻受试老鼠的体重，并有效阻止血栓的形成，对动脉硬化有预防作用。(3)延长蔬菜制品的保存期乳酸菌是蔬菜发酵过程中的主要微生物，其在厌氧发酵过程中产酸从而形成了酸性环境，这种酸性环境对食品中一些腐败菌和病原菌的生长繁殖有抑制作用。在乳酸菌的生长代谢过程中还能产生许多具有抗菌活性的物质，如有机酸、乙醇、过氧化氢和双乙酰等。此外，乳酸菌还是生产细菌素的典型斟45,46】，细菌素是由某些细菌核糖体产生的一类具有抑菌活性的蛋白质，一般可抑制一些亲缘关系相近的细菌，而产生菌对其有自身免疫性。吴荣荣等人147J最近的研究发现戊糖片球菌中的某些种类可以产生细菌素，并具有较宽的抑菌谱。马菊【48J研究发现，植物乳杆菌和戊糖片球菌菌株对革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌、李斯特菌和革兰氏阴性的大肠杆菌、沙门氏菌都具有较强的抑制作用。综上，乳酸菌发酵是一种简单且重要的加工方式，它不但延长了蔬菜的保存期限，而且改善了蔬菜的风味，增强了蔬菜的营养价值。1．3酸菜中风味物质的研究1．3．1酸菜风味物质的来源许多研究表明，酸菜香气和滋味的形成十分复杂，其风味物质是蔬菜在腌制过程中经过理化变化、生化变化和微生物发酵作用形成的。酸菜是由许多不同的化学物质组成的，主要分为水溶性物质和非水溶性物质，前者溶解于水，组成酸菜的汁液部分，如糖、果胶、有机酸、多元醇、单宁物质、无机盐、含氮物质、水溶性微生物等；后者是组成酸菜的固体部分的物质，有纤维素、半纤维素、脂肪、脂溶性维生素、淀粉、色素、矿物质和有机赫、部分含氮物质等14圳。这些物质有的是酸菜风味直接来源，有的则经过复杂的理化变化后生成一系列酸菜特有的风味物质。(1)发酵产生的风味酸菜『F常的微生物发酵作用是以乳酸为主并伴有少量的酒精发酵和微量的醋酸发酵。腌菜乳酸发酵的基本途径如下150J：葡萄糖一1，6．二磷酸果糖一3．磷酸甘油醛一2．磷酸甘油酸一丙酮酸一乳酸(a．羟基丙酸)。发酵的最终产物除乳酸外，还有少量乙醇、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、琥珀酸、高级醇以及二氧化碳、氨等。有时还有微量硫化氢、甲烷。其中，有机酸中的乳酸本来就是一种较好的调味剂，具有温和的微酸味；醋酸虽具有刺激性，但适量醋酸可起调味作用；琥珀酸为一种具有鲜味的有机酸，类似贝类的鲜味，对腌制品有助鲜作用垆¨。醇类等发酵产物本身具有香味，当其与其它产物或调味品之间发生的酯化反应产生多种酯类香味的脂类化合物，也是腌菜风味来源之一。甘蓝在乳酸发酵后熟期间，利用乳酸发酵初、中期产生的乳酸、乙醇作用生成的丙酸乙酯，乙酸与乙醇作 天津科技人学坝I：学位论文用生成乙酸乙酯，这些酯类物质都具有良好的香气1521。(2)蛋白质水解生成的氨基酸蔬菜中含有一定量的蛋白质和氨基酸，一般蔬菜含蛋白质为O．6％'--'0．9％15引。在腌制过程中，蔬菜中的蛋白质因微生物的作用和蔬菜原料所含蛋白质水解酶的作用而被分解为氨基酸从而产生鲜、香味。其总反应方程式为：蛋白质一水解一多肽一水解--*RCH(NH2)·COOH(氨基酸的通式)氨基酸在酸的作用下变成醇，醇与酸化合为酯，产生香味，反应方程如下：C2HsOH+CH3CH(NH2)COOH—，CH3CH(NH2)COOC2Hs+H20(乙醇)(丙氨酸)(香酯的一种)目前，在蔬菜腌制品中发现的氨基酸的种类已确定者达30多种，每种都有一定风味f54】。其中谷氨酸、天门冬氨酸含量最高，而谷氨酸及天门冬氨酸钠盐具有强烈鲜味。研究表明，甘氨酸的甜味为砂糖的O．8倍，丙氨酸的甜味为砂糖的1．2倍，色氨酸的甜味为砂糖的35倍15川。氨基酸还可与醇类起酯化反应生成酯，而具有芳香味。因此氨基酸含量越丰富，则鲜味、甜味和香味越浓。(3)糖苷类物质降解形成的香气一些蔬菜含有某些糖苷类物质。如十字花科蔬菜所含有的芥子苷，在发酵过程中可以降解生成具有特殊香气的芥子油15州。另外，蔬菜本身含有一些挥发性成分，如醇、醛、萜烯类等也具有浓郁的香气。碳水化合物是酸菜干物质的主要成分，它含有糖分、纤维素、半纤维素、果胶等物质。这些物质对酸菜的风味有密切关系。酸菜内的糖分(单糖和双糖)在腌制加工过程中是微生物的营养物质。当乳酸菌在糖介质中活动时，可将糖转变为乳酸、乙醇、醋酸和二氧化碳等。酸菜内存在着糖苷类，它是单糖分子与非糖物质相结合的化合物，它关系到酸菜的色、香、味。青菜头内含有特殊的芥子素，它具有特殊的苦辣味，在腌制加工过程中，由于腌制(踩踏)，压榨使一部分细胞破裂，细胞内的黑芥予苷酶，使芥子苷水解，生成具有特殊芳香而又带刺激性气味的芥子油及葡萄糖和硫酸氢钾，其反应方程式【57l：Clolll6KNS209+2H20=C3GsCBS+C6H1206+KHS04f黑芥子苷)(芥子油)(4)有机酸类有机酸类主要是包括乳酸、醋酸、柠檬酸、丁二酸、苹果酸及琥珀酸等。酸菜腌制品中由于微生物发酵作用产生的有机酸主要有乳酸和醋酸等，是风味的主要来源之一。乳酸本身就是一种较好的调味剂，其温和的酸味使腌制品独具风味，可以增强人们的食欲【5引。醋酸具有刺激性，适量醋酸可起调味作用。柠檬酸有温和而爽快的酸味、苹果酸有爽快的酸味且略有苦味。琥珀酸钠可以用作化学调味剂，具有类似于贝类的鲜味【591。丁二酸对腌制品也有助鲜作用【60】。 l前高(5)产物之间发生反应形成的香气和滋味发酵产生各种有机酸、氨基酸与乙醇发生酯化反应，生成乳酸乙酯、醋酸乙酯、氨基丙酸乙酯等，从而产生不同的芳香。氨基酸可以与戊糖或甲基戊糖的还原产物作用，生成含有氨基的烯醛类的香味物质。氨基酸种类不同时，其与戊糖的反应产生的香味风味也有所差别。除此之外，蔬菜发酵前添加的香料，其香气和滋味也会被蔬菜所吸收，结合蔬菜本身的风味而形成特殊的香味。1．3．2风味物质的分析发酵蔬菜品种丰富，其风味各具特色，也因此成为评判产品质量的一项主要指标。随着现代仪器分析技术的进步，发酵蔬菜风味的形成、检测和评定得以发展。酸菜中主要的风味物质及检测方法见表l一1。 天津科技人学坝l：学位论文酉羹．面_，协麓00。龌器璇医矩敷g曙lI媛癸戆纂藤jc警球．鲞扩燃爨私涨辩咪。嚣扎雹鼙遄鼯疆粼嗽髫警求辩警塔容器姐落埔峨霹3￡u，夔率噪，媳塔．圣f嗵瓣篮谳。◇ou◇，孥l螺翟f唑溅。僦H，q蒌，o函2凳，u19．誊越墨斓哺雌书辆篷喙砖求。瞪塾瞰嗍豫誉猎墨绦落莨苣*篷嘛雒罐娥啦蠊器墨晷铺怔犀嚣睬辑．学嚣霰湘碟辩蹙鏊酶妒，溅溉靼，蕊撩整。喾懒爨客豫《岷垂嘲涉一黑¨卜咬0鹾闷醛显嘲藏．激口磊釉孵，口弑眯溢弗董泠溢水文，骚隧以，蠹牺眯饕瓤球‘县器撑靼落卜⋯。球黼整釉敬犯球簿呶磴酬秫趣落醐繇。蝗霎墨訾区帕隧豫嚷喇案姗翼N斑窿，{|筠篷蠢，№符篷门．旺棼赫彗辩落¨卜．畿赫霜秫殴睁泰粼辩球霞鏊m萎．蓍湘辩蜜叫誊蕊譬煎敝船藩嗤拇．誉篷密莲霰幢犀嘿豫溅骣球，纛拱攥『l睾璺喀落赣。誉落g髅孵璺=噶落辞。圹=暴$$莲．<夺辩球鞋|2瓣禚辫叫卜吱劓。誊釉猫君$辫蜒球黜卜瑟黜瞪，黜门隧落辅栏隧趣篷辐擦睐，器姐￡球篷，营曝录将藩嘁端，裂憾嚣，篷嘛妇斌，烈睬巍，篷憔印，篷瞒秘，藩嘛瞎隘¨卜吱¨，黯州矗，医巡文糖目滔基蹴瞩盎怒篷避，趣r2篷躐，趣闷落闷篷睬静，凝q卜，澄糖轻，藩鬻鬃，落卜，篷区，隘闷，甾簖黪融闷瓣越冬隧引卜矗一，礁卜，臻眩，融心糕霉啦警隧．；晕腻稚粼篷鳓酥糕避粼篷嚣鼹粼黜熊靛率容求燧醇州糕嫠鼙爨黉匿一时oc时T1∽ho们口oc_o—工Ico一≮LI—g．IQpo口口c对∞Do口对=l们D：∽．Io>对一也一。一。一D_E)上蠼恹蘸辑隧脉熏髻峰霉訾区导妹甾二懈 (1)有机酸的分析酸菜腌制发酵产生的酸性物质主要是一些挥发性脂肪酸和一些有机酸。有机酸总酸度一般用酸碱滴定法，测定方法主要有气相色谱法和液相色谱法，也有应用离子色谱法的报道。气相色谱法要求对样品进行衍生化处理，将有机酸变成为弱极性的酯类衍生物以增加其挥发性。通常合成衍生物有三甲基硅烷衍生物、甲酯和乙酯等。当样品比较复杂时，还需通过固相萃取离或离子交换树脂等分离待测有机酸，操作比较繁琐费时【6¨。应用离子色谱法分析有机酸简单快速，选择性好，对于样品预处理的要求也比较简单，但高浓度的无机离子对有机酸根离子的测定会产生干扰，影响其准确性。高效液相色谱法准确度较高，操作简单，在实际应用最为广泛。国标对果蔬及其制品中的酒石酸、柠檬酸、苹果酸、丁二酸等的检测，规定采用高效液相色谱法【62J。目前，高效液相色谱法主要采用紫外检测器，另外还有示差折光检测器和电导检测器等，色谱柱通常采用常规反相C18柱。朱薇等人【6纠采用HPLC法对高盐腌雪菜坯低盐化后有机酸进行了分析研究。贾洪锋等人Mj利用HPLC法测定了发酵产品中的有机酸，建立了同时分析8种有机酸的方法。赵大云、丁霄霖16川，应用GC法，以十二烷为内标，雪里蕻腌菜卤汁中挥发及不挥发性有机酸醋酸、丙酸、丁酸、乳酸及琥珀酸和苹果酸经处理丁酯化后在HP—l毛细管柱上得到了完全分离定量。但张颖、张健【66】在对比HPLC和GC法检测葡萄醋中有机酸效果时发现，由于前处理造成的损失，GC法不宜检测醋酸和乳酸。国外，在对接种发酵生产黑橄榄进行品质监控时，Efstathios等人【67】也采用了HPLC法对其中的有机酸进行定量检测。对于不同的提取方法，董园园等【68】使用蒸馏水提取、80％乙醇提取和蒸馏水．冷冻干燥浓缩提取三种方法分别提取番茄和白菜中的有机酸，并采用HPLC法测定，得出了蒸馏水直接提取法既能有效保证有机酸的提取量，又能大大简化试验步骤的结论。(2)游离氨基酸的分析目i订，氨基酸态氮含量用甲醛滴定法；蛋白质含量用凯氏定氮法∞9J和紫外吸收法等测定。酸菜中游离氨基酸的分析方法有很多，常用层析法(纸层析和薄层层析)和色谱法(GC和HPLC)等。随着科技的进步，平面色谱法现在已被仪器分析法所取代。氨基酸的分析测定法包括离了交换色谱(IEO法、高效液相色谱法、气相色谱法和氨基酸自动分析法等，所用的检测器有荧光、紫外可见光谱吸收、化学发光等。由于氨基酸分析前需要衍生化，目前使用的氨基酸衍生剂还比较少而且容易造成一定误差"⋯，因此，近些年来氨基酸分析一般使用氨基酸自动分析仪，氨基酸自动分析是一种快速分析方法，混合氨基酸通过离子交换树脂进行分离，柱后流出的氨基酸与水合茚三酮反应，最后测定衍生物吸光度并定量得出各种氨基酸的含量。近几十年，氨基酸分析仪的自动化程度有了很大提高，分析时间从几天缩短到几十分钟，检测限也从1．tmol级提高到pmol级。氨基酸自动分析法操作步骤简单，在氨基酸定性、定量分析 天津科技人学坝lj学位论义中一、被广泛应用。霍光华【7lJ使用氨基酸自动分析仪对香椿、荠菜、蕨菜等植物的可食部分进行了分析，并评价了它们的氨基酸组成，为其开发利用奠定了基础。赵大云【72】用氨基酸自动分析仪分析发酵前后的雪里蕻样品，发现雪里蕻菜汁中可与Na+结合而呈鲜味的谷氨酸和天冬氨酸，其游离态含量随腌渍时间的延长而增加。(3)挥发性风味物质的分析食品的风味是一个复杂的系统，由气味和味道组成，分析起来非常困难。传统发酵蔬菜的生产工艺虽然比较简单，但产品的风味物质却并不简单，通常都是多种挥发性物质综合作用下产生的结果。而每一种蔬菜腌制品都有其特征风味物质，且这种特征风味物质挥发性较强，特别是十字花科植物中都含有一种含硫和氮的葡萄糖苷类物质在腌制加工过程，由于内源酶作用下，每一种硫糖苷都能产生相应的特征风味物质"引。酸菜有其自身的特征香气，主要是由异硫氰酸酯类、腈类和二甲基三硫这一组特殊香气成分所形成的，酯类、杂环类及其他含氧化合物也对香气有一定贡献。这些特征香气成分均系原料中的芥子苷在芥子苷酶作用下的水解产物【1训。目前腌制菜香气物质的收集常采用蒸馏、萃取、蒸气蒸馏一萃取、超临界流体萃取、顶空气体捕集等方法，这些方法理论上都可以应用在酸菜香气成分的收集中。萃取法又称浸提法。可直接将风味成分从酸菜腌制品中提取出来，再利用GC．MS技术对酸菜萃取液进行进一步分析，确定组成风味物质的成分。超临界流体萃取法则有效地克服了传统分离方法的不足，它利用在临界温度以上的高压气体作为溶剂，分离、萃取、精制有机成分17川。另外，顶空气体捕集法，是将一定量的固(液)态样品置于有一定顶端空问的容器中，在一定的温度、压力、时间等条件下，收集平衡态的上空气体的方法"6|。目前已得到广泛应用，而且常常与气相色谱法结合，可以用来分析酸菜等蔬菜腌制品挥发性风味成分。常见的鉴定方法有气相色谱一质谱联用仪(GC．MS)法，气相色谱(GC)的保留法、体积法，红外线辐射IR法，核磁共振NMR法等，其中以GC—MS法最为普遍【”J。但是由于目前还没有任何一种仪器能准确测定各个食品风味物质的类型和质量，所以任何风味物质的鉴定还必须配合感官评定，包括香气质、香气量及对加香产品质量改善的评价[78]。1．4酸菜发酵剂的研究进展1．4．1国内市场酸菜概况数据显示，我国酸菜制品年人均需求量为0．8kg，国内每年酸菜需求量己达l10，。-·。西左右，并且年产销量呈逐年上升趋势，年平均增长幅度都在10％以上，预计2011年将达到180万吨以上，而我国酸菜产量偏低，据《生活报》08年的一篇报道称我国酸菜冬季平均产量为5000吨，不足市场容量的1％，因此，我国酸菜生产和销售远没达到饱和状态，均有广阔的市场空问。目前在酸菜生产行业中，部分工厂企业已经实现了酸菜清洗包装的流水线生产， l前言但是在酸菜的生产发酵阶段仍没有脱离传统发酵方式，多采用自然发酵工艺，该工艺的弊端有：(1)发酵周期相对较长，生产力低下；(2)受卫生条件、生产季节和用盐量影响，发酵易失败；(3)发酵质量不稳定，不利于工厂化、规模化及标准化生产；(4)沿用老泡渍盐水的传统工艺，难以实现大规模的工业化生产；(5)异地生产，难以保证产品的一致性；(6)亚硝酸盐、食盐含量高，食用安全性差。为了解决上述问题，国内外相继进行了乳酸菌纯菌种发酵和直投式菌种发酵的研究，取得了较好的效果。乳酸菌作为一种蔬菜腌制剂，和与多种食品质量相关的重要微生物已有较多文献报道【／z列J。研究优良乳酸菌菌种的高效培养技术以及其保藏方法对开发乳酸菌作为蔬菜发酵剂具有重要的现实意义【8¨。在发酵乳制品中已广泛使用经冷冻、浓缩、干燥的乳酸菌发酵剂№引，冷冻干燥浓缩发酵剂可防止菌种失活及复配菌种的比例在保存、扩大培养过程中发生变化，还可防止杂菌污染和省去菌种扩培过程，保证产品质量稳定和可精确控制。目前，此类产品在欧美等发达国家己得到广泛应用，但国内尚未商品化，主要原因是冻干发酵剂生产技术还很不完善，细胞存活率低和保存时间短【831，随着我国乳酸菌技术应用的迅速发展，研究和开发直投式乳酸菌发酵剂势在必行科】。1．4．2纯菌种发酵酸菜的研究早在20世纪60年代，欧洲的PedersonCS和AiburyMNt蹈J就率先将纯菌接种发酵技术应用于泡菜的研究。而后，CaldwellBiofermentationCanadainc．公司在蔬菜发酵领域处于领先地位，并于1998年获得了复合菌种接种的蔬菜(sauerkraut．type)发酵专利技术。成都市调味品研究所李幼筠等于1996年分离出两株乳酸菌：干酪乳杆菌和短乳杆菌，并申请了专利。沈国华I酌J等进行了采用植物乳杆菌或干酪乳杆菌单独或以1：1比例混合的蔬菜接种发酵。毕金峰峭7J等使用明串珠菌4H．．gL酸杆菌进行复配取得了较好的效果。罗云波【88】认为植物乳杆菌、发酵乳杆菌、肠膜明串珠菌以5：3：2较为合适。蒋和体则认为以上的比例为3：1：1比较合适。四川际天时公司、四川大学和西南农大筛选出的纯种乳酸菌菌种可使泡菜的发酵期由传统工艺的25天缩短为2天【89】。然而，上述研究大部分是以缩短家庭发酵酸菜时问为目的，并没有考虑到工业化生产酸菜时pH及总酸含量、色泽、风味1111感等指标需要达到一定的要求，并且需要稳定生产质量。目前纯种乳酸发酵采用的生产工艺有两种：第一种纯菌接种发酵模式是在接种前先对蔬菜原料进行热烫杀菌处理，以杀死大部分附着于发酵原料上的微生物，然后再在无菌条件下进行接种发酵，其发酵风味与单一菌种及复合菌种的关系较为密切；第二种发酵模式是一种半人工半自然的特殊模式，接种前原料不经热烫处理，发酵原料中附着的自然微生物依然存在并参与发酵，而接种的纯菌种只在发酵过程中起优势主导菌群的作用l帅】。1．4．3直投式乳酸发酵剂的研究直投式乳酸发酵剂是将菌体浓缩培养、离心等制成的浓缩菌悬浮液，在发酵阶段 天津科技人学颂h学位论义代替乳酸菌或与其一同加入进行发酵，对于直投式发酵而言，DVS的好坏直接影响到产品的质量和产量。陆利霞等桫IJ以萝卜为原料，用自行分离的植物乳杆菌B2进行单一菌株发酵剂接种制作萝卜泡菜产品，与完全自然发酵产品比较，发现发酵周期、发酵酸度、pH、OD值、风味物质等各指标均优于自然发酵泡菜。杨晓辉等【跚通过试验选出组合A(肠膜明串珠菌肠膜亚种)和组合B(肠膜明串珠菌肠膜亚种：干酪乳杆菌干酪亚种：植物乳杆菌=1：1：2)为优良发酵剂。陈仲翔等【84】通过试验确定了植物乳杆菌发酵剂的最优培养条件是30％的番茄酱离心液，2％水解植物蛋白粉，37。C培养，pH8，接种量为7％，而肠膜明串珠菌则是30％的番茄酱离心液，10％浓缩胡萝b离心液，2％水解植物蛋白粉，30。C培养，pH8，接种量为5％。黄传业等【92】筛选出适合榨菜叶发酵酸菜的发酵剂，得出最优混合发酵剂为肠膜明串珠菌3％、短乳杆菌1％、植物乳杆菌1％，可生产出质地、风味俱佳的酸菜，且发酵时间从自然发酵的15天左右缩短为5天左右。熊晓辉等【93J从泡菜汁筛选出3株产酸量较高、生长良好的菌株，从该菌的形态特征、菌落特征、生理生化特征进行鉴定，判定结果A8、B2为弯曲乳杆菌，B4为植物乳杆菌，以其为纯培养发酵剂制备萝卜泡菜，质量优于自然发酵产品。1．5本课题研究目的及意义1．5．1研究目的我国酸菜的工业化生产程度很低，目前仅有北大荒亲民有机食品有限公司实现了酸菜的大型发酵罐式生产，但大多生产企业采用小作坊式生产，没有形成酸菜的规模化生产，纯粹的手工式的操作已很难在激烈的竞争中占优势，只有形成规模化的生产刊‘能把中国这一传统的酸菜产业做强做大。但是，酸菜工业化的前提是酸菜的工业化发酵和工业化清洗、加工、包装相结合，企业为达到酸菜质量标准，减少酸菜发酵批次的不同而引起的酸菜口感的差异，多数酸菜生产企业采用地窖法生产酸菜，此法与家庭式的酸菜制作有所不同，一是发酵规模大，一般发酵一次需要白菜数百至数千公斤；二是发酵时间长，家庭式发酵酸菜一般在几天至几周内，一般不超过一个月，而目前在工业化方便面等加工食品中使用的料包中的酸菜需要发酵时间长达半年、1年甚至更长时问。然而，许多文献报道都局限于对家庭作坊式的乳酸菌接种发酵进行研究，发酵试验一般都在一个月之内，有的甚至只研究发酵两天后的酸菜，这种只依据短时间内酸菜El感变化及pH变化而设计出的酸菜发酵工艺和发酵剂虽然可以满足家庭式酸菜发酵的需求，却不能达到工厂化酸菜发酵的标准。基于以上原因，本研究针对传统酸菜生产工艺落后，发酵周期长，产品质量不稳止毒问题，采用传统微生物分离技术和现代分子生物学技术分析传统发酵酸菜中的乳酸菌组成，并针对工厂化发酵酸菜的特点及需求，采用产酸快速，耐低pH，生长旺盛，适合酸菜发酵环境的优良复配菌株，进行人工接种发酵酸菜试验，优化工艺条件。并在此结果的基础上进一步对乳酸菌发酵剂的制备进行了研究，采用响应面优化保护剂添加比例，制备酸菜乳酸菌发酵剂。本研究为酸菜乳酸菌发酵剂在酸菜生产中的进 l前高一步研究和推广应用提供理论和实践依据。1．5．2研究意义(1)增加发酵剂种类，开发酸菜专用发酵剂。国外对发酵剂的研究源于20世纪80年代，主要集中在酸奶和干酪方面，应用于蔬菜腌制的则相对较少。在我国，发酵剂的研发与应用还是一个新领域。目前，除乳品的发酵剂有研制和应用外，绝大多数发酵食品还是沿袭传统的自然发酵工艺。因此，适合不同原料发酵的新型发酵剂亟待开发。传统酸菜是靠自然选择进行微生物发酵，存在着发酵周期长、发酵质量不稳定以及不利于工厂化、规模化及标准化生产等诸多弊端。采用酸菜乳酸菌发酵剂不仅可以弥补自然发酵的诸多不足，而且可以最大限度地提高酸菜生产的技术水平和产品质量档次。(2)改善酸菜发酵工艺，提高蔬菜产品附加值。我国蔬菜种植面积占世界总种植面积的1／3以上，产量约占蔬菜总产量的40％，是世界第一蔬菜生产大国，蔬菜发酵加工在我国具有广阔的市场前景，研究发酵蔬菜的现代加工技术，提高蔬菜产品的附加值，是传统发酵蔬菜制品的产业化、国际化、现代化的必然要求。本课题所研究的酸菜乳酸菌发酵剂是一种直投式发酵剂，在减少自然发酵周期长，产品质量不稳定，容易污染腐败的同时，相比于人工接种乳酸菌发酵酸菜也有很大优势，人工接菌工艺繁杂、对操作要求比较高，需要企业额外置购微生物分离、培养、鉴定等一系列设备和仪器，加重企业负担。而直投式发酵剂则减少了繁重的工序和传代复壮次数，有效地防止菌株变异及噬菌体的污染，提高发酵工业的劳动生产率，适应酸菜的工业化生—L广厶。(3)减少食盐添加量，提高酸菜安全标准。现今消费市场流行低盐食品，提倡低盐饮食。高盐食品因盐度太高，对人体某些器官(如肾脏、心血管系统等)会造成永久性损坏，因而人们在消费时存有很大顾虑。传统发酵酸菜由于要防止染菌，会添加过多的食盐，高盐发酵腌制蔬菜口感欠佳、太咸太酸、品种单调。采用直投式酸菜乳酸菌发酵剂，由于产酸快速，发酵时间缩短，因此可以减少食盐用量，解决了高盐份问题，确保了食物安全和消费者健康的需要，不仅可以消除人们对腌制产品的食用安全性担忧，还可以调配成各种宜人的味道，易于被不同层次消费者接受，符合现代社会的消费潮流，具有很广阔的市场自可景。1．5．3论文主要研究内容本论文以不同来源的传统发酵酸菜为研究对象，从酸菜中分离、纯化、鉴定主要乳酸菌，以各种理化性质、风味物质为指标，通过人工接种优化酸菜发酵工艺确定发酵菌种及比例，最后通过响应面法对乳酸菌冷冻干燥保护剂进行优化，制备酸菜乳酸菌发酵剂。主要内容如下：(1)酸菜菌相分析以及乳酸菌的分离筛选及鉴定。从传统发酵酸菜中分离筛选优良乳酸菌菌株。对分离菌株和酸菜中的菌相进行PCR-DGGE分析，确定优势菌株。(2)乳酸菌发酵酸菜条件优化。应用现代色谱，质谱和萃取技术研究酸菜风味物 天津科技人学颁t学位论文质，确定传统工艺酸菜的风味化学成分，比较传统工艺产品与人工接种发酵产品品质，结合感官评价、质构分析、理化指标对两种工艺所生产的产品进行比较，确定不同菌株及比例、接种量、加盐量、初始培养基和白菜是否漂烫等发酵工艺。(3)酸菜乳酸菌发酵剂的制备。利用响应面法对乳酸菌保护剂进行优化，确定最佳保护剂配方，制备酸菜乳酸菌发酵剂。 2材料与方法2．1材料2．1．1白菜、酸菜样品酸菜购于天津农贸市场及民间传统酸菜样品。白菜为北京大白菜，购于天津农贸市场。2．1．2试剂名称规格生产厂家蛋白胨BR北京奥博星生物技术有限公司蔗糖AR天津化学试剂一厂葡萄糖AR天津市福晨化学试剂厂琼脂粉BR天津市福晨化学试剂厂脱脂奶粉天津雀巢有限公司乳清粉新西兰恒天然集团酵母浸膏BR北京奥博星生物技术有限公司三氯甲烷AR天津市四通化工厂无水乙醇AR天津市江天化工技术有限公司甲醇AR天津市四通化工厂乙腈GCMERCK公司硼酸AR天津市凯通化学试剂有限公司草酸AR天津市化学试剂一厂磷酸AR天津市四通化工厂乳酸AR天津市科密欧化学试剂开发中心盐酸AR天津市江天化工有限公司冰乙酸AR天津市四通化工厂柠檬酸AR天津市四通化工厂富马酸AR天津市化学试剂研究所苹果酸AR天津市科密欧化学试剂开发中心酒石酸AR天津市天大化工实验厂琥珀酸AR天津市科密欧化学试剂开发中心异丙醇AR天津市北方化玻购销中心异戊醇AR天津市大茂化学试剂厂苯酚AR天津市四通化工厂乙酸钾AR天津市北方天医化学试剂厂乙酸钠AR天津市北方天医化学试剂厂 灭津科技大学硕二L学位论文酒石酸钾钠AR草酸铵AR碘化钾AR沙黄AR番红AR碘AR溴甲酚绿AR结晶紫AR对二甲基苯甲醛ARN-1-萘基乙二胺盐AR酸盐对氨基苯磺酸AR吐温80CP半胱氨酸ARNaHC03ARCaC03ARCaCl2AREDTAARNaH2P04。2H20ARNa2HP04‘12H20ARKH2P04ARK2HP04ARNaOHARNaClAR(NH4)2804ARFeS04·7H20ARMgS04‘7H20ARZnS04。7H20AR2．1．3仪器与设备名称普通药物天平JA2003型电子分析天平超声波清沈器DELTA．320pH计DZKW．C型水浴锅全自动高压灭菌锅天津市化学试剂一厂天津市科密欧化学试剂开发中心天津市化学试剂三厂天津市天大化工实验厂天津市科密欧化学试剂开发中心天津市化学试剂研究所天津市北方天医化学试剂厂天津市化学试剂批发部天津市科密欧化学试剂开发中心天津市化学试剂研究所天津市化学试剂批发部天津市北方天医化学试剂厂天津市化学试剂三厂天津市四通化工厂天津市科密欧化学试剂开发中心天津大学科威公司天津市四通化工厂天津市化学试剂六厂天津市四通化工厂天津大学科威公司天津市化学试剂三厂天津大学科威公司天津市化学试剂三厂产地上海精科天平厂昆山市超声仪器有限公司法国METTLER—TOI正DO公司河北黄华市航空仪器厂同本YAMAT0公司 2材料!J方法DL201型恒温自动干燥箱HFsafe900型超净工作台厌氧培养箱DY．2LRH．250生化培养箱YSl00生物显微镜BCD．217GM型电冰箱AFl00电子式制冰机超低温冰箱三洋MPF．U4086SSmartsoecTM3000型分光光度计J．25型高速冷冻离心机高效液相色谱仪MastercyclerpersonelPCR仪全自动凝胶成像仪5415D型离心机Power-PAC3000电泳仪SZ．97自动三重纯水蒸馏仪磁力搅拌器变性梯度凝胶电泳系统DGGE．2001冷冻干燥机ALPHA1—2LDplusGC．MS一4000气相色谱．质谱联用仪TA．XT2i质构分析仪固相微萃取2．1．4主要溶液的配制天津市实验仪器厂上海力申科学仪器有限公司浙江义乌冷冻机总厂天津市达北实验仪器厂日本NIKON公司中国Haier公司SANYO制冰系统有限公司同本三洋株式会社美国BIORAD公司美国BECKMAN公司日本日立公司德国eppendorf美国BIO．RAD公司德国eppendorf美国BIORAD公司上海雅荣生化设备仪器有限公司TAMAT0SCIENTIFICCO．LTDC．B．SSCIENTIFICCOMPANY德国CHRIST公司美国VARIAN公司英国StableMicroSystem公司美国Supelco公司(1)生理盐水(O．9％)：9gNaCl溶于1000mL蒸馏水。(2)10mg／mL酚酞指示剂：1g酚酞溶于60mL95％(v／v)L醇中，用蒸馏水稀释至100mL。(3)矿物质溶液：MgS04·7H200．4g，MnS04‘4H200．015g，FeS04·7H20O．98g，NaCIO．01g，蒸馏水定容至100mL。(4)10％(w／v)孚L糖溶液：乳糖10g，蒸馏水定容至100mL，121℃高压灭菌20min或0．2um膜过滤灭菌。(5)革兰氏染色剂：A．结晶紫初染液：结晶紫乙醇饱和液(结晶紫22溶于20mL95％乙醇中)，即A液：草酸铵O．8g，蒸馏水80mL，即B液；将A和B混合均匀24h后过滤即成。B．卢l乇(Lu901)碘液：碘1g，碘化钭J2g，蒸馏水300mL；先将KI溶于3-5mL的蒸馏水中，再加碘片并摇荡使之完全溶解，再加蒸馏水至足量。配制成功后贮于棕色瓶内备用，如变为浅黄色则不能使用。 天津科技人学硕士学位论文C．复染液，番红(用95％酒精配制成2．5％的番红液)10mL，蒸馏水90mL。(6)50xTAEbuffer：Tris242．2g溶于300mLddH20，再加入57mL冰乙酸，100mLO．5mol／LEDTA(pH8．O)，用冰乙酸调节pH至8．0，然后加ddH20定容至1000mL，使用时稀释50倍。(7)STET：8％蔗糖，0．5％(v／v)TritonX一10050mMEDTA(pH=8．0)50mMTris．HCl(用HCl滴定至8．0)。(8)10％SDS-称耿10g十二烷基磺酸纳(SDS)，溶于90mLddH20，加热到68。C，并用磁力搅拌器搅拌有助于溶解，以ddH20定容至100mL。(9)3mol／LNaAC：12．35gNaAC溶解于ddH20中，并定容至50mL。(10)EB储备液(10mg／mL)：1gEB溶于100mL水中，4℃闭光保存，使用浓度为5gg／mL。2．1．5培养基(1)MRS培养基液体培养基：牛肉膏10．Og，蛋白胨10．0g，酵母膏5．0g，葡萄糖20．0g，NaAC5．0g，柠檬酸二铵2g，K2HP042．0g，MgS04·7H200．2g，MnS040．05g，Tween-80lg，蒸馏水定容至】000mL，pH6．2～6．4，121。C高压灭菌20min。固体培养基另加2％琼脂粉。MRS．CaC03培养基：灭菌后的MRS固体培养基冷却至60。C，加入1％灭菌的CaC03粉末(装入试管121。C高压灭菌20min)，混合均匀，倒平皿(2)牛奶平板培养基A脱脂奶粉10g，蒸馏水定容至100mL，115。C高压灭菌20min后备用。B酵母膏2g，琼脂4g，1．6％溴甲酚紫0．4mL，蒸馏水定容至100mL，pH7．2-7．4，121℃高压灭菌20min后备用待溶液温度至50。C下时，将A、B混匀，倒平板。(3)乳清培养基乳清粉409，蒸馏水定容至1000mL，调pH5．5后；100。C水浴40min，8000rpm，4。C离心20rain；上清液调pH6．8后冷却过滤；每100mL上清液添DN-孚L糖1g，葡萄糖O．5g，胰蛋白胨O．5g，L一半胱氨酸盐酸盐0．05g，NaACO．5g，Tween一80O．1mL，矿物质溶液1mL，pH6．2，115℃高压灭菌20min。f4)白菜汁培养基白菜汁培养基(Cabbagejuicemedia，CJM)制作方法参考Nancy等人‘蚓的研究方i厶，并稍加改动。将新鲜大白菜洗净，弃去表皮两层白菜叶。其余白菜切块，按1：1的比例加入蒸馏水，于搅拌机中搅碎，三层纱布过滤，煮沸弃去浮沫。使用前加入1％蛋白胨，115。C灭菌15min。(5)乳杆菌选择性培养基(LBs)称取陆桥公司LBs琼脂培养基723g，蒸馏水定容至1000mL，115。C高压灭菌9 2利料’j方法20mln。(6)LM17培养基称取Difco公司M17培养基37．25g，蒸馏水定容至950mL，121℃高压灭菌15min，冷却到50℃，添加50mL10％(w／v)灭菌的乳糖溶液。(7)YEPD培养基蛋白胨2g，酵母膏1g，葡萄糖2g，蒸馏水定容至100mL，pH6．0，121℃高压灭菌20min。2．2试验方法2．2．1酸菜中乳酸菌的分离纯化(1)无菌称取20g酸菜及菜汁，用研钵磨碎，倒入装有180mL无菌生理盐水及玻璃珠的锥形瓶中摇匀后进行梯度稀释，取0．1mL适当梯度的稀释液分别涂布于MRS、MRS—CaC03、LM17、LBs、牛奶固体平板上，37。C厌氧培养72h。(2)挑取典型单菌落，在固体培养基上划线分离，反复纯化后进行革兰氏染色、接触酶试验和凝乳试验。(3)革兰氏染色为阳性，接触酶试验为阴性，能够凝乳的菌株初步判定为乳酸菌，并保存于．80℃甘油管中。2．2．2PCR—DGGE法分析酸菜菌相(1)乳酸菌DNA的提取乳酸菌基因组DNA提取采用SDS法，具体方法如下：①取酸菜汁1．5mL，8000rpm离心10min，弃上清。1mL无菌水洗涤菌体两次，振荡悬浮菌体。②加入500laLSTET，50I．tg／laL溶菌酶，振荡，37。C温育lh，加入150gL20％SDS(w／v)，37℃保温30min。③加入300gL5molNaCI，混匀，12000rpm离心15min，耿上清④加入等体积酚／氯仿／异戊醇(25／24／1)振荡混匀，12000rpm离心20min，重复2次取上清。⑤上清加入10％NaAC(pH5．4)和等体积的异丙醇，混匀，冰浴30rain，12000rpm离心15min弃上清。⑥用70％乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心15min，弃上清，晾干。⑦加入20此TE缓冲液溶解DNA，一20。C保存。(2)PCR扩增细菌16SrDNA的V3可变区扩增：上游引物为gc338ff5'-CGCCCGCGCGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG．3’)，下游引物为518R(5’．ATTACCGCGGCTGG．3’)。引物由上海生工合成提供。20 天津科技人学颂I二学位论文以酸菜中乳酸菌基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系如下：10xBuffer2；5“LddH2018．5“L模板DNA1．0lxL上下引物各O．5此dNTPs2IxLTag酶0．2此反应总体系25此细菌扩增条件：95℃预变性5min95℃变性1min、65。C退火1min每次降o．5℃至55。C}-(30个循环)72℃延伸1minJ72℃延伸6minPCR产物经0．8％琼脂糖凝胶电泳检测后，．20℃冰箱保存备用。(3)PCR产物分析①称取0．24g的琼脂糖，加入30mLlxTAE，微波炉中火1min使琼脂糖溶解。②待盛有琼脂糖的锥形瓶不烫手时，将琼脂糖倒入制胶模具，迅速在模具一端插上梳子，检查有无气泡。③室温下放置20min后，琼脂糖溶液完全凝固，小心取出梳子，将凝胶放置于电泳槽中。④加入电泳缓冲液至电泳槽中，让液面高于胶面1mm，取扩增产物3此，点样。⑤接通电泳槽与电泳仪的电源，80V电泳50min。⑥将凝胶用EB染色20min，通过全自动凝胶成像仪检测电泳结果。(4)DGGE分析①灌胶玻璃和垫条的处理：用洗洁液仔细清洗玻璃板，横擦竖擦3遍，并用自来水彻底冲洗然后用去离子水漂洗干净。操作时必须带手套，取板时握住板的边缘，以避免手上的油脂印在板的工作面上。②灌胶玻璃板的安装与封闭：将长板平放在桌上，将挚条放置于两侧，放上短玻璃板，对齐。③凝胶板的制备：用50xTAE、40％丙稀酰胺／双丙烯酰胺(37．5：1)，按照下表分’’。㈡i茂35％署u50％的变性剂浓度的储液。先分别加入7mL35％的储液和7mL50％的储液，接着加入35此浓度为10％的过硫酸铵，再加入10“L的TEMED，在梯度形成器中混合形成线性梯度，快速灌胶直至灌满至玻璃板顶部，然后立即插入梳子待胶凝固。变性剂浓度梯度组成：(100mL)，配制方法见表2．1。 2材料’j方法表2．1变性梯度胶的配制Table2—1Preparationofdenaturationgradientgel④预热缓冲液：配制20LTAE缓冲液，上样前将其加热到60。C。⑤加样：取15gLPCR产物，注入到加样孑乙底部。⑥电泳：PCR产物的DGGE分析在DGGESystem上进行。变性梯度从30％～60％，在1xTAE缓冲液中，110V电泳8h。⑦EB染色：将DGGE胶用EB染色30min，用凝胶成像系统观察胶板。2．2．3乳酸菌发酵酸菜条件优化应用试验所分离并筛选的菌株作为发酵剂，综合国内外参考文献，选定18-20℃为发酵温度，按图2．1所示接种发酵工艺流程，接种量8％，菜水比为1：1(质量体积比)，18-20℃下发酵时间为60天；以菌种比例、葡萄糖添加量、食盐浓度(相对与菜重)、初始发酵剂载体和原料漂烫与否为因素进行正交试验，各因素水平如表2．2。酸菜发酵所用容器为酸菜坛，体积为6L，装菜量大约为2．5kg，加水约为2．4L，坛口水封，每批次发酵酸菜的量随试验处理数不同而不同，每组处理只发酵一坛酸菜。表2-2正交试验因素7k平表Table2-2Levelsandfactorsinorthorhombicexperiment菌种比例所用菌种为肠膜明串珠菌：植物乳杆菌：干酪乳杆菌。●阜-'rl食盐、发酵剂—』竺=-—◆了K白菜挑选与清洗—_晾干—_装坛—_压实—jr．寸腌制图2．1接种酸菜发酵工艺Fig．2—1TechnicalprocedureforprocessingofinoculatedSuanCai22 天津科技人学硕二f：学位论文2．2．4感官评价使用10分制评分法进行检验，评分法是最常用的一种感官分析方法，是以数字标度形式来检验产品质量，所使用的标度为等距标度或比例标度。感官评定在试验室玻璃房内进行，室内通风良好，无不良气味，采用白色日光灯照明，环境温度22~25。C。①评审团成员：邀请19名学生和一位老师担任评审员。要求评审员身体状况良好且24h内不得食用刺激性食品。评审前半小时对评审团全体成员进行简单培训。②器具：白色洁净的一次性纸盘和纸杯。③样品处理：各取样品50g，编号，置于一次性纸盘中央。④评定方法：品评两个样品需间隔3分钟以上，纯净水漱口后方可进行下一样品的评定。感官评分主要从样品的色泽、香气、质地与味道进行评分，各评分权重为见表2．3。表2．3酸菜感官评分依据Table2-3SensoryevaluationcriteriaforSuanCai2．2．5质构分析将酸菜切成厚0．2mm，边长为0．8～lcm相同大小的块状，进行TPA(二次咀嚼试验)试验，试验条件为：P／36R探头下试验参数设置为：探头预压速率2mm／s，下压速率lmm／s，压后上行速率1mm／s，2次压缩中问停顿5S，试样受压变形为45％，触发力值5g。2．2．6理化指标的测定(1)pH和总酸的测定直接使用pH计测定酸菜发酵液的pH。总酸使用滴定法测定，以乳酸计。精确吸取酸菜发酵液10．00mL，放入150mL三角瓶中，加入50mL蒸馏水，加入10mg／mL酚酞指示剂3滴。用O．0500mol／L氢氧化钠标准溶液滴定至微红色，以30S内不褪色为终点。记下耗用O．0500mol／L氢氧化钠标准溶液的毫升数。在同一条件下做一空白对照，记下耗用NaOH标准液毫升数VO，按下列公式计算。X2-!!=_二』尘土掣x1oo王℃(2-2)————————二7——一^Juu—L、10×竺S式中：X2——样品中总酸(以乳酸计)含量，g／100g；卜样品耗用氢氧化钠标准溶液的体积，mL；％——空白耗用氢氧化钠标准溶液的体积，mL； 2材料与方法广氢氧化钠标准溶液实际浓度，mol／L；0．0卜与1．00mL氢氧化钠标准滴定溶液[c(NaOH)=I．000mol／L]*l|当的乳酸的质量，g：W一样品质量，g；S——样品稀释液体积，mL。(2)酸菜乳酸菌菌数测定无菌称取20g酸菜及菜汁，用研钵磨碎，倒入装有180mL无菌生理盐水及玻璃珠的锥形瓶中摇匀后进行梯度稀释，取O．1mL适当梯度的稀释液涂布于MRS固体平板上，37。C厌氧培养48h，对菌落数在30～300范围内的平板进行菌落计数。2．2。7有机酸分析(1)样品前处理．称取样品10g，加入50mL重蒸水匀浆，75。C水浴加热30min，冷却至室温，滤纸过滤，定容至100mL，45lma膜过滤。(2)色谱条件有机酸含量的测定采用HPLC法。色谱条件为：色谱柱：ApolloC18(51ttm，250x4．6mm)，柱温25。C，流动相为0．5％(NH4)2HP04一H3P04(pH2．5)缓冲液，使用前用O．45rtm滤膜抽滤，流速为1．0mL·min～，紫外检测波长210nm，进样量20此。(3)分析步骤①标准曲线制作准确称取各有机酸标准品0．5g，以重蒸馏水溶解并定容至100mL。从中吸取20．0mL再次定容至100mL，即为1．0mg／mL标准贮藏液。分别吸取贮藏液0．50、1．oo、2．oo、5．00、10．00mL，加入O．2mLlmol／LH3P04，以重蒸馏水定容至10mL。进样量20恤L分别检测。分别测定不同标准品出峰时间，及其不同浓度所对应的峰面积，制作标准曲线。②样品测定各待测进行样品处理后上机检测，记录数据，与标准曲线对照定量计算。2．2．8挥发性风味成分的测定使用固相微萃墩(SPME)联合气棚色谱／质谱(GC—MS)i910定传统酸菜与人j—[接种发酵酸菜产品挥发性风味物质。(1)固相微萃取(SPME)样品制备耿酸菜发酵液各2mL，放入5mL的萃耿瓶中，拧紧瓶盖。将手动固相微萃取器的萃取头插入到样品瓶盖中，推出纤维头，500C吸附30rain。随后抽回纤维头，拔出萃取头，再将萃取头插入气相色谱仪推出纤维头，在进样口解吸附15min，进行GC—MS检测分析。 天津科技大学硕士学位论文(2)分析条件采用气相色谱／质谱联用进行测定。气相色谱条件：色谱柱为VF一5MS30mx0．25mm×0．25ILtm弹性毛细管柱；载气He气；载气流量1mL／min；进样口温度250。C；分流比5：1；升温程序为40。C保持3min，5。C／min线性升温至150。C，10。C／min线性升温至250。C，然后于250。C保持5min。质谱条件：离子源为EI源，离子阱温度220。C，传输线温度280。C；扫描范围50～1000amu；电离电压为70eV；溶剂延迟4min；谱库NIST05。2．2．9乳酸菌冷冻干燥保护剂的优化(1)冷冻干燥发酵剂的制备将活化好的菌种按3％接菌量接到MRS液体培养基培养，37℃，厌氧培养24h后，在4500rpm，4。C离心15min，弃上清收集菌体。按菌泥：保护剂为l：3(w／v)配比，将菌泥与保护剂混匀，分装到平板中，．80℃预冻3h。最后冷阱温度．51℃，真空度O．09mbar，真空冷冻干燥24h，得到冻干菌粉。(2)中心复合试验设计(CCD)及保护剂的响应面法优化依据本实验室的前期探索和对相关文献的总结酸菜发酵剂的初始保护剂配方定为：海藻糖1．5％，甘油0．5％，山梨醇2％，麦芽糊精1％，脱脂奶10％。应用CCD设计对脱脂奶、海藻酸钠和甘油浓度进行进一步优化，试验因素及水平见表2．4。表2—4CCD试验设计表Table2-4ExperimentdesignofCCD(3)发酵剂菌活测定以0．85％生理盐水为介质，无菌条件下，将菌粉按l：100(w／v)的量接入到生理盐水中，37。C活化30min后，测定活菌数。2．2．10统计分析正交试验设计与数据的统计分析采用PASWstatistics18(SPSS)软件，响应面法试验设计与优化采用Design．Expert7软件实现。 3结果oj讨论3结果与讨论3．1酸菜菌相分析目前，对传统发酵食品中微生物的分析还是采用分离、纯化、鉴定的方法，需要做一系列繁杂的形态特征和生理生化试验。这种方法的缺点是，即使采用最复杂的试验组合也不能对分离物作精确的鉴定，不能反映分离物间的系统发育关系，更不能获得微生物多样性的真正概貌【9川。近年来，由于16SrDNA的分子生物学技术促进了微生态研究的发展，特别是被称为DNA指纹技术的变性梯度凝胶电泳法(DGGE)，能有效分析复杂微生物群落及其多样性，且无需培养微生物，因此该方法越来越受到重视。由于该方法可以使仅有2个碱基差别的核酸序列在梯度凝胶电泳中完全分离，因此有很高的分辨率，能提供有关群体结构和差异的信息【96‘。本研究采用PCR．DGGE分子生物学技术，研究传统发酵酸菜中的细菌群落结构，为进一步筛选优势乳酸茵及改良其生产工艺提供理论依据。’3．1．1酸菜细菌基因组DNA的提取图3．1为选取传统发酵酸菜进行细菌基因组DNA的电泳图，由图可知，基因组DNA条带均一，大小超过15kb，且条带的亮度可以满足作为PCR模板的要求，以此为模板进行PCR扩增。·—一15kbt一1kb图3—1传统酸菜细菌基因组DNAFig．3—1DNAoftraditionalSuanCaieubacteria3．1．2PCR扩增图3．2为以细菌基因组DNA为模板进行PCR扩增的电泳图。所用引物为细菌16SrDNA的V3可变区的通用引物M，上游引物为gc338f(5'-CGCCCGCGCGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAG一3’)，下游引物为518R(5’一ATTACCGCGGCTGG一3’)。 天津科技大学硕士学位论文图3-2细菌PCR产物Fig．3—2PCRampliconsofeubacteria如图所示，PCR产物条带为200bp左右，且特异性较好，没有杂带，可以进行DGGE分析。3．1．3酸菜菌相的DGGE分析图3．3为PCR产物进行DGGE的电泳图。图3·3细西DGGE图谱Fig．3—3DGGEprofileofeubacteria从DGGE图谱可以看出，传统发酵酸菜中细菌的种群结构较为复杂，大约有6条明显的电泳条带，至少有6种菌存在于发酵酸菜中，也说明DGGE能很好的分析出酸菜中的乳酸菌菌相，酸菜发酵中乳酸菌的种类繁多；其中条带l、2、3、5、6的亮度微弱，说明此酸菜样品中，这几个条带所代表的微生物含量比较少；其中条带4最亮最宽，是酸菜发酵中的优势菌株，在发酵过程中起着主要作用。 3结果与讨论3．2酸菜中乳酸菌的分离3．2．1酸菜乳酸菌的分离纯化按照2．2．1试验方法对酸菜中的乳酸茵进行分离纯化，通过菌落形态和显微形态观察及生理生化试验从14种不同来源的酸菜中共分得48株乳酸菌，图3．4为较为典型的菌株10、13、30这三株菌的菌落形态及显微形态。形态描述、培养基种类及凝乳时间见表3．1。表3．1乳酸菌分离结果Table3．1Resultsofisolationoflacticacidbacteria 天津科技人学硕士学位论文 3结果与讨论由表3．1可知，共分得球菌3株，杆菌45株，凝乳时I’自J最短的仅为12h，最长达到26h，凝乳时间大部分集中在16～20h之间。这表明酸菜中乳杆菌占绝对优势，为其主要发酵菌株。 图3—4(a)乳酸菌菌落图Fig．3—4Ca)ColonypictureofLAB蔷￡”％，‰蕊0∥。．≯熟7参。矗：≮jl忿I鳞嚣(b)乳酸菌菌体形态图(100x)(b)MorphologypictureofLAB(1oo×)3．2．2乳酸茵的PCR—DGGE分析选取9株代表菌株进行PCR．DGGE鉴定，图3—5为其DGGE电泳图，其中泳道4为实验室保存的一株植物乳杆菌作为对照菌株。 3结果Ij讨论图3-5乳酸函DGGE分析Fig．3—5DGGEanalysisoflacticacidbacteria由图可知，9株菌中有7株为植物乳杆菌，因此可以判定，之前对酸菜菌相DGGE分析中最亮的条带应为植物乳杆菌，传统发酵酸菜中植物乳杆菌为其主要发酵菌种。有报道称酸菜发酵初期大多为异型乳酸菌发酵，主要为肠膜明串株菌启动发酵，随着pH的降低，异型乳酸菌减少，由更加耐酸的同型乳酸菌继续完成发酵，发酵菌株主要为植物乳杆菌【9引。我们的试验结果与此报道相符，因此，在随后的人工接种发酵酸菜试验中，我们采用一株植物乳杆菌MA2和一株肠膜明串株菌CGMCC1．2138为固定发酵菌株，并和其他菌种进行配比，以期寻找出最佳发酵菌种比例。3．3酸菜发酵菌种、时间的确定3．3．1酸菜发酵菌种的确定现代研究已经证实酸菜发酵前期由肠膜明串株菌启动，随后植物乳杆菌占据优势，继续完成发酵。酸菜中分离出的乳酸菌主要有肠膜明串株菌、植物乳杆菌和干酪乳杆菌以及戊糖片球菌、短乳杆菌和嗜酸乳杆菌等。因此，本试验以肠膜明串株菌、植物乳杆菌和干酪乳杆菌为主要发酵菌种。目前，国内外有许多关于酸菜发酵剂研究的报道，其中所涉及的菌种比例差异较大，参考意义不大，因此本节试验的目的在于研究此三种菌的配比对酸菜口感风味的影响，找出合理的配比范围。由于酸菜行业内主要以pH和总酸含量为指标，在pH3．2～3．8，总酸含量为0．8～1．2mg／100mg的范围内的酸菜为合格产品。因此，本试验主要依据这两个指标和感官评定进行分析。以食盐浓度为2％，接种量为8％，发酵时间为60天，菌种比例顺序为肠膜明串株菌：植物乳杆菌：干酪乳杆菌进行发酵试验，试验结果见表3．2。 天津科技入学硕Ij学位论文表3-2不同菌种比例对酸菜pH和总酸的影响Table3-2EffectsofdifferentLABratioOnpHandtitratableacidityofSuanCai由表3—2可知，四组试验的pH和总酸含量没有显著差异，但是，当肠膜明串株菌：植物乳杆菌：干酪乳杆菌为1：l：1和1：3：1时，酸菜pH低于行业标准；并且，酸菜1和4的151感过酸，颜色较深，质地较软，而酸菜2和3的pH和总酸含量符合行业指标，口感较好，酸度适中，酸菜菜叶颜色为嫩黄色，菜帮为透明状白色，表明酸之酵适中。因此，酸菜发酵菌种确定为肠膜明串株菌、植物乳杆菌和干酪乳杆菌，菌种比例在2：1：0～l范围内。3．3．2酸菜发酵时间的确定以食盐浓度为2％，接种量为8％，菌种比例为：肠膜明串株菌：植物乳杆菌：干酪乳杆菌为2：I：l，发酵时间分别为30天、60天和90天进行乳酸菌酸菜发酵，试验结果见表3—3。表3-3发酵时间对酸菜pH和总酸的影响Table3-3EffectsoffermentationperiodOnpHandtitratableacidityofSuanCai由表3．3可知，随着发酵时问的延长，酸菜pH逐渐降低，总酸含量逐渐升高。在发酵30天时，虽然pH达到行业标准，但此时总酸含量太低，不符合行业标准；当发酵60天时，pH和总酸含量均在行业标准范围内；当继续发酵至90天时，酸菜pH过低，超出行业标准。同时感官分析也表明发酵30天的酸菜口感单薄，鲜味不够明显，菜帮颜色不透明，表明发酵不够彻底；而发酵60天时的酸菜醇厚感强，鲜味明显，菜帮颜色均一、透明，表明发酵完全；发酵90天的酸菜口感过酸，质地发软，颜色发暗，表明发酵过度。因此，采用乳酸菌接种发酵酸菜的发酵时问以60天为宜，相眇千丁厂自然发酵酸菜长达半年以上的发酵时间，乳酸菌接种发酵酸菜效果显著，。．。趴1入迷缩短发酵时间，提高生产效率。3．4酸菜发酵条件优化3．4．1酸菜发酵过程中pH变化发酵过程中pH是微生物在特定的环境下代谢活动的综合指标，是一项重要的发 3结果Ij讨论酵参数，它对微生物的生长和代谢产物的形成有重要的影响。不同种类的微生物对pH的要求不同，一般真菌生长的pH范围广，而细菌较窄。同一种微生物在不同的生长阶段和不同的生理生化过程中，对环境的pH也有不同的要求，同一种微生物由于环境pH的不同，可能积累不同的代谢产物。因此pH的变化不仅会引起发酵过程中微生物的生长和种类消长，而且还会影响菌体代谢途径的改变和代谢产物的产生，影响到酸菜的风味。分别制作食盐浓度为2．5％，5％的酸菜，接种量为8％，菌种比例为肠膜明串株菌：植物乳杆菌：干酪乳杆菌为2：1：1，对其进行pH跟踪监测，结果如图3-6。02468101214161820时问图3-6不同食盐浓度酸菜pH变化曲线图Fig．3-6ChangesinpHduringfermentationofSuanCaiwithsalt从图中可以看出，食盐浓度对酸菜发酵过程中pH的变化没有显著影响，这是由于我们所接种的植物乳杆菌MA2具有较高的耐盐性，盐浓度在5％内的变化没有影响菌体生长。由图可知，酸菜发酵过程可分为发酵初期、发酵旺盛期和发酵末期三个阶段。在发酵初期，pH的变化不是特别明显，发酵速度比较缓慢，发酵旺盛期pH显著下降，发酵木期pH保持稳定。这是由于酸菜发酵过程中的初期乳酸菌对环境还不够适应，菌数较少有关，进过短暂的调整，由于附着在白菜上的天然乳酸菌和人工接种乳酸菌大量繁殖，从而分解白菜中的葡萄糖产生乳酸及其它风味物质，使酸菜的pH值快速下降，进入发酵中期。在第11天的时候pH出现一次小波段的下降，其原因可能是异型发酵乳酸茵变弱，同型发酵乳酸菌成为优势菌株，产酸加快而引起。随后，发酵过程达到末期，酸菜pH基本稳定在3．2左右。3．4．2接种酸菜发酵条件正交试验结果根据试验方法2．2．3中的正交试验表头用SPSS软件进行正交试验设计，并依据试验方法2．2．3所述的酸菜工艺流程进行人工接种发酵酸菜。发酵结束后按试验方法 天津科技人学硕fj学位论文2．2．4进行评分。试验结果见表3—4。方差分析结果见表3．5。表3．4正交试验结果Table3-4Resultsoforthogonalexperiment编号ABCDE感官评分7．26．14．18．78．16．68．36．26．34．66．56．85．15．65．8162l135．3注：A、B、C、D、E分别代表漂烫、盐度、葡萄糖,忝Dil量、菌种比例以及初始发酵剂载体表3—5正交试验方差分析Table3．5OahogonalexperimentVARAanalysis冈素偏差平方和自由度均方值FLI；显著性漂烫1．26611．26610．176+盐度葡萄糖添加量菌种比例初始发酵剂载体0．00110．15731．262321．95230．00l0．0520．4217．3170．0050．4203．38258．832误差0．49740．124注：*表示p<0．05，具有显著性；++表示p<0．01，具有极显著’性影响本次接种发酵酸菜『F交试验的因子主次顺序为E>A>D>C>B，即：初始发酵●431，41432321l12121，203●2032，O32●121，212●212l21212l2，23456789m“佗BM埒 3结果‘j讨论剂载体>漂烫>菌种比例>葡萄糖添加量>盐度，最佳发酵条件为A2BlCoDlEl，即：白菜不漂烫!盐度1％(相对于菜重)，不添加葡萄糖，初始发酵剂载体为脱脂乳，菌种比例肠膜明串珠菌：植物乳杆菌：干酪乳杆菌为2：1：1。由正交试验方差分析结果可知，初始发酵剂载体对酸菜的口感有极显著的影响，添加用脱脂乳培养的乳酸菌发酵的酸菜口感较好，而添加乳酸菌菌泥发酵的酸菜口感较差，这可能是因为由于脱脂乳可以兼做乳酸菌的保护剂，在培养环境改变后，环境中的渗透压、矿物质浓度以及温度的改变会对乳酸菌造成一定程度的抑制，而脱脂乳成分复杂，具有丰富的氨基酸、大分子蛋白等可以阻挡外界环境的剧烈改变；单纯添加乳酸菌菌泥发酵酸菜时，乳酸菌直接暴露在发酵液中，发酵初期，白菜中的细胞液没有渗透到盐水中，此时乳酸菌得不到足够的营养物质，并且，白菜之间的物理摩擦也可能降低乳酸菌的生存几率。白菜是否漂烫对酸菜口感也有显著影响，漂烫过后发酵的酸菜口感不如不漂烫的，这是由于白菜漂烫过后，可能杀死白菜表面原有的乳酸菌，直接减少了可能产生风味物质的乳酸菌种类，另外，白菜漂烫过后，破坏果胶、纤维素的结构，影响了酸菜的脆度。在低盐浓度、低葡萄糖添加量范围内，盐浓度、葡萄糖添加量以及菌种比例没有显著影响。本着节约发酵成本、简化操作工艺的原则，通过正交试验，我们得到了人工接种发酵酸菜最佳工艺为：接种量8％，菜水比为l：1，菌种比例为肠膜明串珠菌：植物乳杆菌：干酪乳杆菌2：1：1，菌种原始培养基为脱脂乳，食盐浓度1％(相对于菜重)，18-20℃下发酵时间为60天。对正交试验中感官评分最高的样品4、5、7进行进一步的理化指标和风味的检测。3．4．3理化及风味指标的检测(1)pH和总酸的测定样品4、5、7以及传统发酵酸菜的pH和总酸含量见表3-6。表3-6不同样品的pH和总酸Fig．3-6pHandtitratableacidityofdifferentsamples由表3-6可知，3个样品的pH都在3左右，与传统酸菜pH接近；3个样品的总酸含量都在0．8M．2mg／100mg之间，在行业标准范围内，但是传统酸菜的总酸含量最高，这是因为传统酸菜发酵时间为6个月，是样品发酵时间的3倍，酸菜可以积累大量的乳酸。(2)有机酸分析 天津科技人学硕Ij学位论文图3．7为7种有机酸标准品的HPLC检测图谱：其中峰1为草酸，峰2为苹果酸，峰3为乳酸，峰4为乙酸，峰5为柠檬酸，峰6为富马酸，峰7为琥珀酸。图3．7有机酸标准品高效液相色谱图F喀3—7HPLCchromatogramofnormalorganicacids图3．8(a)、(b)、(c)、(d)分别为样品4、5、7和自然发酵酸菜有机酸色谱图，对比四个图可以发现，三个样品的有机酸图谱就出峰数量而言与自然发酵酸菜的图谱基本相同，说明人工接种发酵酸菜和自然发酵酸菜在有机酸的组成上非常相似。0246810121{RetentionTimelmin)图3-8(a)样品4有机酸HPLC图谱Fig．3-8(a)HPLCchromatogramsofsample40O删m如 3结果’j讨论毫V皇I：#皇三名一皇'．墨暑羞％一暑：g：1000400O800'700600500{OO300200100Ol234S67B9lO11121314RetentionTi雎Imin}图3-8(b)样品5有机酸HPLC图谱Fig．3-8(b)HPLCChromatogramsofsample5RetentionTime(sin}图3-8(C)样品7有机酸HPLC图谱Fig．3-8(C)HPLCchromatogramsofsample7图3-8(d)自然发酵酸菜有机酸HPLC图谱Fig．3-8(d)HPLCchromatogramsofnaturalfermentedSuanCai38 天津科技人学硕I：学位论文根据标准品的保留时间与含量标准曲线，测得样品4、5、7和自然发酵各有机酸含量见表3—7。表3．7接种发酵酸菜中有机酸的含量Table3-7OrganicacidscontentsofinoculatedSuanCai有机酸是构成酸菜风味的主要物质，柠檬酸有爽快的酸味，苹果酸具有温和爽快的酸味，略有苦味，酸菜中不含苹果酸，柠檬酸含量较低，而酸味较尖利的乳酸含量高，可以推测酸菜的酸味较尖利且爽快感低；琥珀酸是一种具有鲜味的有机酸，其钠盐具有独特的类似贝类的鲜味，有研究表明，琥珀酸钠含量为0．114％时就足够呈现出一定程度的鲜味，经过发酵以后，新鲜白菜中结合态的琥珀酸释放出来，在食盐的钠离子的作用下呈现鲜昧。三个样品与自然发酵酸菜中的有机酸种类和含量并无明显差异，但样品4中的草酸含量最少，草酸可与食物中的钙结合形成草酸钙，从而影响钙的吸收，酸菜中应尽可能减少草酸含量；同时样品4中的乳酸、柠檬酸、富马酸和琥珀酸的含量都是三个样品中最高的，并且，琥珀酸含量与自然发酵酸菜中的含量相当，具有较高的鲜味，与其最高感官评价得分相一致。(31酸菜的质构分析TPA质构测试又被称为两次咀嚼测试(TwoBiteTest，TBT)主要是通过模拟人口腔的咀嚼运动，对固体半固体样品进行两次压缩，通过输出质构测试曲线，从中可以分析质构特性参数【99】，其中重要的参数有硬度、弹性、咀嚼性等，各参数具体意义为：硬度是使食品达到一定变形所需要的力，食品保持形状的内部结合力；黏着性反映了咀嚼时对上腭、牙齿、舌头等接触面黏着的性质；弹性是样品经过第一次压缩以后能够再恢复的程度；黏聚性反映的是咀嚼时抵抗受损并紧密连接、使之保持完整的性质，它反映了食品内部结合力的大小；回复性反映了食品受压后迅速恢复变形的能力；咀嚼性综合反映了食物对咀嚼的持续抵抗性，咀嚼性类似于感官评定中的韧性，咀嚼性越强，食品越难被嚼碎。表3—8为三个样品及传统发酵酸菜的TPA试验结果。 3结果’j讨论表3-8酸菜的‘rPA试验结果Table3-8TPAresultsofinoculatedSuanCai由表3．8可以看出三个样品的质构分析结果与自然发酵相似；在弹性、粘聚性方面，三个样品与自然发酵结果没有显著差别；自然发酵的硬度、胶着度、咀嚼度、回复性、粘着性均比三个样品大，样品4与之最为接近；样品4的咀嚼度为三个样品中最大，通过感官评价也可以得出样品4的口感较好，弹性适中，清脆有咬劲，与自然发酵酸菜口感一致。(4)挥发性风味成分分析根据以上试验结果，对口感最好、感官评价得分最高的样品4利用SPME．GC．MS进行进一步挥发性风味成分分析，图3-9为自然发酵酸菜和样品4的挥发性成分质谱总离子流图。图3-9(a)自然发酵酸菜挥发性成分总离子流图Fig．3-9(a)TotalionchromatogramofvolatilecompoundsinnaturalfermentedSuanCai 天津科技人学硕：l二学位论文_’驯№图3-9(b)样品4挥发性成分总离子流图Fig．3-9(b)Totalionchromatogramofvolatilecompoundsinsample4图中所示为含量较高的10种物质。分别为1、丙二醇甲醚醋酸酯，2、醋酸，3、乙酸乙酯，4、二甲基二硫醚，5、环庚三烯，6、42．羟基丙酸乙酯，7、3一庚烯．1醇，8、二甲基三硫，9、2,4．二甲基噻唑，10、4．乙基一5．甲基噻唑GC．MS分析显示，人工接种发酵酸菜中有27种物质被检出，其中含硫类化合物5种；而自然发酵产品中检出的物质有33种，含硫类物质7种。全部检出的非含硫类物质中，分离鉴定结果主要为酯类、醛类、酮类、醇类及硫醚类、烷烃类、酚类、烯烃类和一些杂环类化合物。其中以酯类、酮类和醇类组分居多，分别鉴定出9个酯类组分，6个酮类组分和6个醇类组分。在自然发酵酸菜和乳酸菌接种酸菜中都有检出硫醚类组分二甲基二硫醚、二甲基三硫醚、二甲基四硫醚，自然发酵酸菜中的含硫物质总含量相对较高，它们对葱属蔬菜及其加工产品的特征风味贡献较大，都具有葱．肉特殊香味【100'101】。其中，二甲基二硫(Dimethyldisulfide，DMDS)和二甲基三硫化合物(Dimethyltrisulfide，DMTS)是新鲜大白菜及其发酵产品的主要挥发性物质，大蒜中也含有这些物质。DMDS有刺激性的洋葱气味，阈值为0．16---0．12I．tg／kg，DMTS具有肉香、洋葱、蔬菜样香气，阈值为0．005～0．01pg／kgll021。它们的前体是L．S．甲基半胱氨酸亚砜，为一种游离氨基酸，取样过程中在实验温度下降解生成硫醚类组分。在本试验中，两个样品中均发现了一种异硫氰酸酯类，即异硫氰酸苯乙酯。异硫氰酸酯类物质被认为是含黑芥子苷类十字花科蔬菜及其加工品的独特风味组分，它有强烈的催泪性和辛辣味。与之相比，腈类物质是以卷心菜为代表的多种蔬菜的香气成分，其气味要比异硫氰酸酯类物质柔和。试验结果显示，接种发酵酸菜中苯基丙腈含量高于自然发酵酸菜，而其中的异硫氰酸苯乙酯含量较低，因此，可以推测接种发酵酸菜较自然发酵酸菜风味更为柔和。造成这一现象的原因可能是接种发酵使pH下降较快，且在较低pH下所经历时间略长于自然发酵产品，最终pH也较低，更有利于腈类物质的生成。 3结果‘j讨论综上所述，挥发性风味物质检测结果表明，接种发酵酸菜中含有几乎全部传统酸菜中的特征风味物质，但风味物质含量有所降低，这在一定程度上会降低酸菜口感，但并不明显，在工业化大规模生产时，人工接种发酵酸菜不失为一种可行的办法。由感官评价、理化指标的测定以及风味物质的分析可知，样品4所用发酵条件在缩短酸菜发酵时间的同时并没有显著影响酸菜的口感和风味，并且理化指标均在要求范围内，因此，样品4所用发酵条件即为乳酸菌接种酸菜最佳发酵条件，图3．10为最佳发酵条件工艺的流程图。肠膜明串株菌]2：1：1混合植物乳杆菌I一—堕!堕+水]干酪乳杆菌一j1％食盐(按菜重)Jf(10％脱脂乳分别培养14h)l码放整齐l18～20℃白菜——挑选与清洗—叶晾干—生-发酵罐J-发酵—竺型L成熟图3．10乳酸菌接种酸菜发酵工艺Fig．3-10TechnicalprocedureforprocessingofLABinoculatedSuanCai3．5发酵剂的制备3．5．1菌活多元二次模型方程的建立与检验本试验所要优化的冷冻干燥保护剂基础配方是在前期试验的基础上进行的，对乳酸菌已有较好的保护作用，并且由于本试验所用乳酸菌种类较多，对所有乳酸菌菌株进行冷冻干燥保护剂的优化不够实际，而且会增加企业负担，不利于工厂化生产，因此本试验以植物乳杆菌MA2为代表菌株，进行保护剂配方的进一步优化。根据表2—4CCD试验设计表以及试验方法2．2．9进行了20组试验，其结果见表3-9。表3-9CCD设计及结果Table3-9ResultsofCCDexperiment 天津科技大学硕Ij学位论文通过DesignExpert软件对表3-9试验数据进行二次多项回归拟合，获得发酵剂菌活数对脱脂乳、海藻糖以及甘油的二次多项式回归方程为：Y：：4．88+0．84A+0．99B+4．86C．0．0lAB一0．04AC．0．06BC．0．04A2-0．2582-3．79C2式中，Y为预测响应值，A、B、C分别为脱脂乳、海藻糖以及甘油的编码值。该二次回归方程方差分析结果见表3—10。表3．10CCD试验方差分析Table3—10VarianceanalysisofCCDexperiment 3结果与讨论3．5．2菌活晌应面交互作用与优化由菌活多元二次模型方程所作的响应曲面图及其等高线图见图3．11。各因素及其交互作用对响应值的影响结果可通过该组图直观反映出来。已抖0000暑菌活图3·l1(a)脱脂奶一海藻糖含量对菌活的影响(C=0)Fig．3—11(a)Effectofskimmilkandtrehalosecontentonsurvivaloffreeze-driedMA2(C=O)0000＼-、、c：¨。mm；i、A悦咐奶菌洒图3—11(b)脱脂奶．甘油含量对菌活的影响(B=0)Fig．3—1I(b)Effectofskimmilkandglycerolcontentonsurvivaloffreeze-driedMA2(B=0) 天津科技人学硕：i：学位论文C=itl沁"二名《凛椭。。C：油。o500、＼＼＼／／，。o50B：海藻椭_'∞a图3-11(c)海藻糖一甘油含量对函活的影响(A=0)Fig．3-11(c)Effectoftrehaloseandglycerolcontentonsurvivaloffreeze—driedMA2(A=0)由响应面图和相应等高线图可知：在本试验水平范围内，随着保护剂中脱脂奶、海藻糖、甘油浓度的增大，MA2发酵剂菌活数增加，但其浓度超出一定量时，反而抑制发酵剂的茵活数，所以每种物质的添加量都有一个最优的范围，经软件优化分析可得最优水平，根据实际生产情况，将上述三种组份优化为：脱脂奶添加量为10％、海藻糖1．6％，甘油0．6％，此时发酵剂的菌活可达4．09×10¨cfu／g。优化后的保护剂配方为脱脂奶添加量为10％、海藻糖1．6％，甘油O．6％，山梨醇2％，麦芽糊精1％。3．5．3验证试验按照上述保护剂配方做重复试验，三次试验MA2发酵剂菌活平均值为4．8×10¨cfu／g，表明模型的有效性为93．1％，说明模型能较好的反映实际情况；同时，对肠膜明串株菌和干酪乳杆菌进行冷冻干燥试验，试验结表明肠膜明串珠菌菌活可达2．5×1011cfu／g，干酪乳杆菌菌活可达7．6×10mcfu／g，优化后的保护剂对乳酸菌都有较好的保护效果，有实际应用价值。 4结论本试验对自然发酵酸菜中的乳酸菌进行了分离与鉴定；以各种理化性质、风味物质为指标，通过人工接种优化酸菜发酵工艺确定发酵菌种及比例；最后通过响应面法优化乳酸菌冷冻干燥保护剂，确定酸菜乳酸菌发酵保护剂配方，得到的结论如下：(1)通过菌落形态和显微形态观察及生理生化试验从14种不同来源的酸菜中共分得48株乳酸菌，经形态学鉴定，其中球菌3株，杆菌45株；对其中的9株典型乳酸菌进行PCR．DGGE法分析，其中7株为植物乳杆菌。(2)对酸菜发酵过程中pH变化研究表明：酸菜发酵可分为发酵初期、发酵旺盛期和发酵末期三个阶段。在发酵初期，pH的变化不是特别明显，发酵速度比较缓慢，发酵旺盛期pH显著下降，发酵末期pH保持稳定。(3)通过单因素试验及正交试验，以感官评分法为依据，对人工接种酸菜进行发酵条件优化，结果为：影响接种发酵酸菜的因素主次顺序为初始发酵剂载体>漂烫>菌种比例>葡萄糖添加量>盐度，最佳发酵条件为：接种量8％，菜水比为1：l，菌种比例为肠膜明串珠菌：植物乳杆菌：干酪乳杆菌为2：1：1，菌种原始培养基为脱脂乳，盐度1％(相对于菜重)，18～20℃下发酵时问为60天。(4)对酸菜优化试验中感官评分最高的三个样品：样品4、5、7的理化检测表明三个样品的pH都在3左右，总酸含量都在0．8～1．2mg／100mg之问，与传统酸菜接近，但是传统酸菜中的总酸含量稍高。(5)通过HPLC对酸菜有机酸分析，结果表明三个样品与自然发酵酸菜中的有机酸种类和含量并无明显差异，但样品4中的草酸含量最少；同时样品4中的乳酸、柠檬酸、富马酸和琥珀酸的含量都是三个样品中最高的，并且，琥珀酸含量与自然发酵酸菜中的含量相当，与其最高感官评价得分相一致。(6)TPA试验表明样品三个样品的质构分析结果与自然发酵相似；在弹性、粘聚性方面，三个样品与自然发酵结果没有显著差别；自然发酵的硬度、胶着度、咀嚼度、回复性、粘着性均比三个样品大，样品4与之最为接近；样品4的咀嚼度为三个样品中最大，通过感官评价也可以得出样品4的口感较好，弹性适中，清脆有咬劲，与自然发酵酸菜口感一致。(7)对样品4的挥发性风味物质检测巾，检⋯27种物质，其中含硫类化合物5种；而自然发酵酸菜中检出33种，含硫类物质7种。全部检出的非含硫类物质中，分离鉴定结果主要为酯类、醛类、酮类、醇类及硫醚类、烷烃类、酚类、烯烃类和一些杂环类化合物。其中以酯类、酬类和醇类组分居多．分别鉴定出9个酯类组分，6个酮类组分和6个醇类组分。乳酸菌发酵酸菜中含有几乎全部传统酸菜中的特征风味物质，但风味物质含量有所降低，这在⋯定程度上会降低酸菜口感，但并不明显，在工业化大规模生产时，人工接种发酵酸菜不失为一一工叶，可行的办法。(8)利用响应面法对乳酸菌冻干保护剂进行优化，确定最佳保护剂配方为脱脂乳 10％、海藻糖1．6％，甘油0．6％，山梨醇2％，麦芽糊精1％。以此配方对乳酸菌菌活进行了验证试验，试验结果表明植物乳杆菌菌活可达4．8X1011cfu／g，肠膜明串珠菌菌活可达2．5X1011cfu／g，干酪乳杆菌菌活可达7．6X1010cfu／g，优化后的保护剂对三种乳酸菌都有较好的保护效果，有实际应用价值。 5腱掣5展望本文对酸菜中乳酸菌进行了平板分离，得到了其中主要乳酸菌，但由于时间所限并未对全部乳酸菌进行分析，对此未来可使用分子生物学手段，如16SrDNA测序等，进行进一步探讨。本试验使用乳酸菌接种发酵酸菜的方法在保持传统酸菜风味的同时缩短了酸菜生产周期。但是，由于场地及设备的原因，没有进行大规模发酵试验，今后的研究中可对其扩大生产进行进一步探讨。由于条件所限，本试验未对人工接种酸菜进行氨基酸分析，而氨基酸种类与含量对酸菜的风味有重要的影响，因此，今后的研究可以对其进行氨基酸分析，进一步阐述酸菜风味机理，寻找最佳发酵工艺。 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