大熊猫Ⅱ类MHC功能基因的分离及适应性进化研究

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1、浙江人学博上学位论文大熊猫II类MHC功能基因的分离及适应性进化研究摘要主要组织相容性复合体(MajorHistocompatibilityComplex，MHC)是脊椎动物所特有的多基因家族，能编码种类丰富的细胞表面糖蛋白，具有呈递抗原、启动免疫应答的功能，是动物适应性免疫系统的重要组成部分。哺乳动物II类MHC包括DRA、DRB、DQA和DQB等多个经典基因，编码呈递细菌类外源性抗原分子；II类MHC基因的exon2编码抗原结合部位，具有高度的多态性，与物种抵抗病原体的能力及对复杂环境的适应性直接相关。本研究以大熊

2、猫指名亚种的“卧龙种群”、“成都种群”和秦岭亚种的“佛坪．楼观台种群”共121只个体为对象，通过对功能性II类MHC经典座位的分离和遗传变异分析，揭示了大熊猫u类MHC基因多样性的维持机制及其与免疫相关的适应性进化特性。主要的研究结果如下：1)首创了磁珠富集杂交eDNA分离MHC基因的方法。该方法简单、快速、高效。本文运用这一方法分离获得了7个II类MHC基因，共10条全长cDNA。该结果不仅重复获得了文献所报道的“大熊猫II类MHC基因组计划”已确认的6个表达的经典座位，还新发现和克隆了一个新的座位DRB3，从而表明

3、了所建方法的有效性。2)本文分离获得的lo条大熊猫II类MHC基因的全长cDNA(DRA1条，DRBl2条，DRB31条，DQAl2条，DQA21条，DQBl2条，DQB21条)均可以编码完整的蛋白质序列。因此，目前已发现的大熊猫具有功能的经典II类MHC基因，包括DRA、DRBl、DRB3、DQAl、DQA2、DQBl和DQB2等7个。3)在以大熊猫“卧龙种群”、“成都种群”和“佛坪．楼观台种群”的121只个体为对象，并利用座位特异性的PCR．SSCP基因分型和测序方法进行6个II类MHC功能基因的遗传变异检测中，共

4、克隆了25条等位基因。其结果，发现DRA和DQB2均为单态，而其余4个座位则是中度多态的(6条DRB3等位基因、7条DQAl等位基因、4条DQA2等位基因、6条DQBl等位基因)．与其他濒危的哺乳动物相比，大熊猫的适应性免疫系统(II类MHC)具有更丰富的基因多样性。4)在大熊猫的人工圈养种群中，“卧龙种群”和“成都种群”具有相同的等位基因数目，但其分布频率差别明显。进一步的分析发现，“卧龙种群”存在着明显的奠基者效应，其种群中的优势等位基因被主要奠基者携带的等位基因所统治。U浙江大学博士学位论文大熊猫II类MHC功能

5、基因的分离及适应性进化研究鉴此，基于维持圈养大熊猫的遗传多样性及提高大熊猫的疾病抵抗能力的必要性，本文建议应加强该种群携带稀有等位基因之大熊猫个体的繁殖成功率．5)大熊猫指名亚种和秦岭亚种在多态的II类MHC基因中，具有明显的等位基因丰度差异。其中，指名亚种在DQ区比秦岭亚种具有更多的等位基因(16：10)，但秦岭亚种在DR区的等位基因数又多于指名亚种(11：9)。与此同时，在DQ区和DR区，指名亚种和秦岭亚种分别具有9条和5条各自所特有的等位基因。上述结果，充分表明了大熊猫指名亚种和秦岭亚种在其亚种分化之后，各自经历

6、了独立的进化历史，并进化产生了适应不同环境的亚种特异性II类MHC基因。6)在大熊猫II类MHC基因中，存在着多个方面的平衡选择证据：a．基因的观察杂合度明显高于期望杂合度；b．各基因抗原结合位点的氨基酸杂合度显著地高于非抗原结合位点(P

7、的适应性进化过程中，发挥了重要作用。7)大熊猫指名亚种在DRBl和DQA2座位上的选择参数∞值均小于1，属于净化选择模式，表明了净化选择在指名亚种的DRBl和DQA2基因中，是处于统治地位的。相反地，秦岭亚种的选择参数∞值在7个表达的II类MHC基因中均大于1，属于正选择模式，表明了正选择广泛地存在于秦岭亚种的II类MHC基因中。该结果，明晰地揭示了大熊猫指名亚种和秦岭亚种在II类MHC基因的进化机制上，存在着驱动因素的差异。8)无论是大熊猫的指名亚种还是秦岭亚种，在新发现的DRB3座位上，都具有极大的∞值(抗原结合位

8、点的∞值均大于9．27；非抗原结合位点的∞值均大于4．39)，表明了DRB3新座位的抗原呈递结构域在其漫长的进化过程中，经历了有别于其它哺乳动物之极强的正选择作用。此外，两亚种的DRA和DQB2基因均为单态，表明了大熊猫的DRA和DQB2基因在其进化过程中，历经的进化选择模式，为极强的净化选择作用。而两亚种在DRBl、DQAl和D