RNA干扰沉默乙肝病毒X基因表达实验性治疗肝细胞癌的研究

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1、博士学位论文英文摘要摘要背景：肝细胞癌(HepatocellularCarcinoma，HCC)是癌症的第三号杀手。尽管目前诊疗手段日新月异，但HCC进展迅速，患者往往在确诊后约6个月死亡。因此我们需要寻找一种更有效的治疗方法，而基因治疗的兴起，为从根本上彻底治疗该病带来了希望。我国HCC患者血清乙肝病毒表面抗原阳性率逾90％。研究发现，80％以上HCC患者的肝组织中含有特异性的HBx蛋白，并有充分的实验依据说明HBx蛋白与HCC的发生与发展关系甚为密切，因此HBx基因可能为HCC基因治疗的理想靶基因。RNA干扰是在双链RNA介导下特

2、异性转录后基因沉默。大量研究表明RNAi现象不仅是一种经济、快捷、高效的抑制基因表达的技术手段，而且有可能在基因功能测定、基因治疗等方面提供新的方法。研究围绕“沉默HBx基因表达治疗HCC研究"进行。目的：RNAi沉默HBx基因表达治疗肝细胞癌。方法：以人肝癌细胞株MHCC97-H细胞gDNA为模板，PCR克隆HBx基因片段，测序和Blast分析；通过HBx全基因扩增，初步研究HBx基因3’末端与HBVDNA整合位点之间的关系；设立严格对照，用RT-PCR和细胞免疫荧光染色分析MHCC97-H细胞内皿x基因转录及HBx蛋白表达。按sh

3、RNA设计原则，依据从MHCC97-H中克隆HBx基因序列，设计并合成编码shRNA三对寡核酸序列(含无关对照序列)，经退火成互补双链，克隆至PGenesil-I载体；行酶切、PCR和测序鉴定；将鉴定的shRNA质粒脂质体转染MI-ICC97-H博士学位论文英文摘要细胞，观察EGFP表达，流式细胞分析转染效率。电穿孔转染将三种构建的质粒导入MHCC97-H细胞；G418筛选、挑单细胞克隆；用半定量RT-PCR及细胞免疫荧光分析单细胞克隆中靶[句shRNA对HBx基因mRNA及细胞内船x蛋白水平的影响。对HBx表达下调的单细胞克隆，体外

4、实验分析细胞周期、细胞增殖；裸鼠体内单细胞克隆成瘤情况：并对成瘤组织行病理分析。结果：在MHCC97一H细胞中克隆、测序获247bpHBx基因片段，Blast分析证实整合的HBx基因为adr亚型(C基因型)；HBx全基因扩增失败，推测船VDNA整合位点可能位于HBx基因3’末端，导致整合HBx基因3’末端缺失；MHCC97一H细胞整合HBx基因转录mRNA并表达HBx蛋白。酶切、PCR及测序证实pshRNA．X164／X215／MOCK载体构建成功；转染48h后MHCC97-H细胞发出绿色荧光，pshRNh-X215转染效率最低。经过

5、30一35天筛选，pshRNA．X215／X164／MOCK质粒转染后分别挑取了109个、184、60个单细胞克隆；半定量RT-PCR分析：与姗ICC97H比较，MOCK各单细胞克隆HBxmRNA水平变化不明显；与MOCK02克隆比较，X215有6个克隆有HBxmRNA水平的下调约为70—93％，X164各克隆下调≤25％；与MOCK02克隆比较，21543克隆胞内HBx蛋白水平下降；细胞周期检测，21543比MOCK02克隆：GO／G1期：86．93±1．00％VS65．97±2．43％，S期：7．39±0．97％VS19．53±2

6、．23％(PO．05)；裸鼠异位移植肿瘤生长体积MOCK02：766．6±117．8mm3，21543：255．3±66．1mW(P

7、MHCC97-H细胞是选择性表达HBx基因的人肝癌细胞株。构建了靶向整合于人肝癌MHCC97-H细胞HBx基因特异性shRNA表达质粒，并成功转染人肝癌细胞MHCC97-H。RNAi沉默MHCC97一H细胞HBx基因表达能明显延缓MHCC97-H细胞生长，对HCC有一定的治疗作用；表明HBx基因在维持肝癌肿瘤细胞生长中起重要作用。关键词肝细胞癌，HBx基因，RNA干扰，基因治疗，MHCC97-H细胞Ⅱl博士学位论文英文摘要ABSTRACTBackgroundHepatocellularcarcinoma(HCC)hasbeenrank

8、ingthethirdleadingpatientssufferingfromcancertodeath．WtllthegreatprogressionoftreatmentsforHCC，mostoftheHCCpat