单基因遗传病的研究方法与技术

《单基因遗传病的研究方法与技术》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、单基因遗传病的研究方法与技术宋书娟医学遗传学系细胞楼304室电话：82802975shujuansong@bjmu.edu.cn已知致病基因突变分析基因突变基因突变稳定突变：传递中不改变原有的突变。动态突变：传递中不断改变自己，多见于短重复序列的突变，在一代代传递中重复次数发生明显变化。三核苷酸重复突变基因突变类型点突变：只有一个或几个核苷酸的改变，是突变中最多见的形式。突变的结果分为：同义突变、错义突变、无义突变、剪切突变等。碱基的插入和缺失：基因编码序列中插入或丢失一个或几个碱基，其结果是突变点下游碱基序列发生移码，编码氨基酸序列都发生改变，又称移码突变（fram

2、eshiftmutation），并可在突变点下游提前出现终止密码。基因突变类型框内突变（inframemutation）：3个或是3的倍数的碱基缺失或插入导致的突变，使基因丢失或增加1个或几个氨基酸。DNA大片段缺失或复制（largedeletionorduplication)：几百个bp至几十个kb的碱基缺失或复制。各种类型病理性突变的比例无义突变和移码突变：60％稀有的错义突变：20％DNA大片段缺失或重复:20％微小突变基因突变分析所用实验材料临床样本取材：外周血组织毛囊颊粘膜脱落细胞羊水细胞绒毛实验应用材料：DNARNAProteinRNA的优点与缺点优点:不

3、包含内含子RT-PCR能够检测异常的剪切体缺点:不易获得要求操作特别小心且快速以免降解目的基因可能不在获得的材料组织中表达导致RNA不稳定的突变不能被检测聚合酶链式反应分子杂交基因突变分析常用技术Southern印迹杂交例如：脆X综合征若X染色体在Xq27.3处呈现细丝样结构，且连接的末端形似随体，这条染色体就被称为脆性X染色体。主要临床症状：智力低下、语言障碍、性格孤僻、伴有特殊面容——长脸、方额、大耳朵、嘴大唇厚，青春期后可见明显大于正常的睾丸。通贯掌、三叉点C缺如。Xq27.3前突变和全突变正常CGG<6-54前突变CGG55-200全突变CGG>200Sout

4、hern杂交法诊断FragileXF:FullyexpandedandmethylatedNM:MethylatedXdonotcutwithEclXIP:UnmethylatedpremutationN:XinnormalmaleandactivenormalfemaleMullisF"forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method"聚合酶链式反应（PCR）聚合酶链式反应于1983年由美国Cetus公司的K.Mullis建立，并和定点突变的发明者M.Smith一起荣获1993年度诺贝尔化学奖，为生命科学领

5、域的研究开创了崭新时代。PCR反应的特点特异性强引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性灵敏度高指数增长，从pg(10-12)可扩增至mg(10-6)水平简便、快速2～4小时完成扩增对标本的纯度要求低DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模板DNA的体外复制包括3个步骤：变性（denaturation）:94C~95C退火（annealing）:40C~70C延伸（extension）:72C3个步骤作为PCR的一个循环，每当完成一个循环，一个分子的模板被复制为二个，产物量以指数形式增长。PCR反应原理和反应过程5’5’3’3’d.NTPs耐热DNA聚合酶引物5’

6、3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’添加反应混合液及样本变性5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’退火加入试管中延伸5’3’5’3’5’3’5’3’继续延伸5’3’5’3’5’5’TaqTaq3’5’3’TaqTaq5’5’循环5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’3’5’3’第二个循环4个拷贝第三个循环8个拷贝5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’5’3’第n个循环2n个拷贝PCR反应体系参与PCR反应的主要成份:模板、引物、dNTP、T

7、aqDNA聚合酶和缓冲液等。引物(Primers)引物决定PCR扩增产物的特异性和长度化学合成的寡核苷酸能与模板特异地结合引物决定产物的特异性和长度引物设计时必须遵循一些原则设计引物的原则：二条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负链序列互补长度为18~25个核苷酸二条引物之间避免形成引物二聚体引物的碱基组成应平衡引物的5`端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位点、生物素等标记）DNA聚合酶TaqDNA聚合酶复制的保真性：TaqDNA聚合酶无3’→5’外切酶活性，因而无校正功能，在复制新链的过程中会发生碱基错配。TaqDNA聚合酶在每次循环中产生的移