马铃薯脱毒苗的RTPCR检测技术研究

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1、山东农业大学硕士学位论文马铃薯脱毒苗的RT-PCR检测技术研究姓名：孙琦申请学位级别：硕士专业：作物遗传育种指导教师：张春庆2003.6.17关于学位论文原创I燧和使用授权的声明零入繇呈交戆学盈论文，是在导簿指导下，独立进行科学磺究所取褥的成果。对在本论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贯献的个人戏集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本入承担。本人宠全了解由东农整大学春关傈餐鞠饺弼学位论文的规定，飕意学校保爨靼按要求匈溷家有关部门或机构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农妲大学可以将本学位论文盼全部或部分内容编入有关数据窿进耄亍捡索，可鑫采琵

2、影棼、缩印或其毽复制手段保存论文霸汇编本学位论文。保密论文在解密殿应遵守此规定。论文作者签名导瘁签名翻期越越隶嵌娩走掌鞭±喾缝论交马铃蔫拦毒苗的lit．PCR检舅技术研究纂蔓毽铃薯薅毒璃遵彰虢骂铃装生产戆重要嚣予。解决这一滴题豁：霎妥逡径就是培养髓鸯姚拳申薯或狩茵，瞧脱毒菌最蠢宠全脱毒嚣经检测才能诚实。本文主要五}}究了橙染马铃謦的两种主要瘸攥，即马铃簿1『瘸霉(Potatov注撼Y+戳帮≥警马簧萋X瘸簿(Potato～irusX，PVX)瞧爱转录PCR一(RT-PCR)检测技术。并将这蝗技术与方法应用于生产祥晶的稔滴：、磷、过本实验，可以衔到潋下结论；l。凌避了黔淑撵鬏

3、方法．帮茬疆褰露不麓入液蒙．粕入氯蘩采掇铡RNase的作用。遗～改进应掰予“一步法”每“CTAB法”并获得了残功。2．鹅改遴的“CTAB法”成功鲍提取丁马铃蓦块茎巾的RNA，这种方法誉餐去多耱魄狡褥交+嚣盛节誊戎本，攮露薄荸。3．对骛铃薯X瘸毒静jE隶分离物与福递分离揍的蕊嗣拳刭进嚣魄较+楚箕夕}壳蛋嬲旗因序列的嗣源区设计一对引物，建立了马铃薯X稽毒魏艇’．PCR捡灏薅搴。4．对马铃薯￥瘸毒黪两个攘系，N辕累(PVY“)与O株系(PVY％的旗豳序列进行比较，在箕外凇蚤白睁歹U阍源区设计～对Sf翰，建立了pVy“与w≯’邋躐黪PV￥薅薅RT-PCR硷测俗夏。5。}￡较马铃鬻

4、Y病毒的N株系与。株系的基因序硎，雀筒源匿的～处设计一条3’引搦，在葵上游的差舜醒两链～个依据N株系。另一个议撂。撩系分弱设i中了磋釜5‘差器引戆，建立了霹臻意马铃鏊Y薅毒N攘系与。株系的熨岔RT．PCR体黎。马铃蒜税毒苗酌RT-PCR检测拄术研究6．为了窳理PVX、PVY病毒的阐时检测，初步建立了PVX、PVY瘸毒兹复合RToPCR体系．同对扩蹭蹬PVX、PVY鹣特巽往繁。7．为了降低实验成本．对已建立的PVY、PVX两种病毒的RT-PCR检测体系进程改进。即在会成cDNA第一条链的原成中，降低AMY思量，设置了AMV的几个不戮掰量，研究发瑷，当反转激薅降低为lU，仍链

5、保证完成检测。本实验将这两个改进的体系用于生产的样品的检测均获得了成功。8．应掰已建立好静PVX、PVY豹RT-PCR捡测技术，对髓毒马铃薯品种。鲁引一号”与来自静南地区的玛铃薯样品进行了检测．结果发现，RT-PCR方法检测病毒既哭敏又赢效fVl关键词：马铃薯：马铃薯Y病毒：马铃薯x病毒：反转录代R；检斌。寨农韭大攀螽鹾￡学篷论之S1相iesoRthemethodsofdetectingvirus-freeseedpotatoesbyRT—PcRSunOi(Agronomycollege．shandongAm'icurmralUniversity．Taian．shando

6、n§271018)AbstractWtrusisanimportantfactorthataffectsthepotato‘sproduction．whichemphsizestheneedforvirus-freeseedpotatoes．Therefore．thetechnology-ofdetectingvirusisvery．necessar)：Thefastm弛)dsofdetectingpotatovirusXfPVX)andpotatovirusY(PVY)byRT-PCRwc

7、rcstudiedtodetectpotatosamples．Theresult

8、s聪糙obtainedasfollows：(1)TheRNAextractionmethodswereimproved：chloroformwasaddedinplaceofliquidnitrogentoreb盘rairl1L'qasew慨thematerialwasgrinded。Theimprovementwassuccessfullyappliedto”singlestepmethod"and¨CTABmethod”．(2)ThetotalRNA粉extractedbytheimproved’"CTABmethod”f