革兰阴性菌产超广谱β内酰胺酶耐药的分子机制研究

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1、中山大学博士学位论文革兰阴性菌产超广谱β-内酰胺酶耐药的分子机制研究姓名：陆坚申请学位级别：博士专业：内科学指导教师：唐英春2003.4.28中山大学博士学住论文中文摘要革兰阴性菌产超广谱B一内酰胺酶耐药的分子机制研究专业：内科学博士生：陆坚指导教师：唐英春教授摘要＼革兰阴性细菌是导致医院内感染最为常见的病原菌。革兰阴性细菌产生质粒／——弋介导的超广谱B一内酰胺酶(ExtendedspectrumB—lactamases，ESBLs)是导致其对新型广谱B．内酰胺类抗生素产生耐药性的重要原因。近20余年来，广谱B一内酰胺类抗生素在临床治疗中广泛

2、应用所产生的选择压力已使产ESBLs临床分离株的发生率呈现出逐年上升的趋势，给临床抗菌治疗带来严峻挑战。因此，完善ESB弘s产酶菌的临床检测方法，揭示其分子流行病学特征和耐药性产生的分子机√制；9探讨ESBLs分子衍变规律和酶促反应蛋白构象的结构特点，将为产ESBLsI／细菌的临床监测、预防和治疗，以及新型广谱6．内酰胺类抗生素的研究开发提供方法和理论依据。为此，我们收集了华南地区医院内感染产ESBLs革兰阴性细菌进行了下列研究；1．多重聚合酶链反应检测超广谱且一内酰胺酶方法的建立。一(收集2001年6月至2001年9月间，华南地区医院内感染

3、无重复临床分离株，共296株。采用美国临床实验标准委员会(NCCLS)筛选ESBLs的方法，筛选出疑产ESBLs细菌共54株，包括：肺炎克雷伯菌31株、产酸克雷伯菌5株、大肠埃希菌18株。通过排序比较，选择B．内酰胺酶TEM、SHV和CTX—M型基因编码区保守序列，设计型特异性通用引物，建立多重(Multiplex)PCR反应体系；对产ESBLs标中山大学博士学位论文中文摘要准株及54个疑产ESBLs临床分离株进行ESBLs的检测；并通过PCR产物克隆测序及NCCLS表型确认实验的平行检测对该法进行应用评价。结果显示，MultiplexPeR

4、法对NCCLS法阳性株及阴性株ESBLs的检出率分别为94．3％(33／35)和26．3％(5／19)；对32个临床分离菌的PCR扩增片段进行了基因测序，证实了该法的特异性，且敏感性较高：84．2％(32／38)ESBLs基因型为CTX-M型，15．8％(6／38)为SHV型。上述结果表明，该法的建立能为临床检测ESBLs及其分子流行病学研究提供一种特异、敏感和高效的检测和研究方法。。y／2．华南地区质粒介导超广谱B一内酰胺酶的耐药性及其分子流行病学研究bf收集2001年4月至2001年9月间，华南地区医院内感染无重复临床分离株，7共1184

5、株。包括克雷伯菌属338株、大肠埃希菌449株、肠杆菌属190株、沙雷菌属46株、枸橼酸杆菌属24株、变形杆菌属3l株、摩氏摩根菌8株、普罗威登斯菌5株、产碱杆菌属19株、不动杆菌属45株、黄杆菌属29株。采用API20E系统(BieM6rieUX，法国)进行鉴定。采用NCCLS表型筛选和确认试验进行ESBLs产酶株的识别，E-test法检测各亚型ESBLs的MICs值，肠杆菌科基因组内重复一致序列聚合酶链反应(ERIC—PCR)进行克隆株的DNA分型，质粒接合及电转化实验、耐药质粒提取及酶切指纹分析、等电聚焦电泳、PeR通用引物扩增TEM、

6、SHV、CTX—M、VEB、PER、SFO基因及其克隆测序进行ESBLs基因分型和质粒定位。结果革兰阴性菌ESBLs的检出率为14．6％(173／1184)；获得产ESBLs接合子67株、电转化子11株，其中产CTX—M—14型ESBLs为33．3％(26／78)、CTX—M一3为23．1％(18／78)、CTX—M一9为14．1％(11／78)、CTX—M一5为6．4％(5／78)、CTX～M一13为2．6％(2／78)、SHY-5为7．7％(6／78)、SHV一12为5．1％(4／78)及SHg～2a为2．6％(2／78)，未定型为5．1

7、96(4／78)；29．5％(23／78)野生株伴产广谱酶TEN—l或SHV一1型；各型ESBLs基因约定位在35～190kb大小的可接合性低拷贝数天然质粒上；CTX—M型ESBLs以对头孢噻肟高水平耐药为特征。对CTX—M一3产酶株深入研究以阐述产ESBLs细菌的分子传播机制。结果显示其耐药基因定位在66Kb和75Kb两种接合性质粒上，66Kb的质粒同时携带Ⅱ中山大学博士学位论文中文摘要TEM一1基因；从不同来源的CTX-M一3产酶株中可以分离到同种耐药质粒，染色体DNA同源性分析显示其为不同的克隆株。上述结果表明，华南地区质粒介导的ESB

8、Ls以CTX-M型衍生酶为主，SHV型其次；对头孢噻肟高水平耐药为其特征；未发现TEM、VEB、PER、Toho型ESBLs。CTX-M一3型ESBLs产酶株的传播