小冰麦异附加系TAI27中异附加中间偃麦草染色体文库构建及抗病基因研究

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1、东北农业大学博士学位论文小冰麦异附加系TAI-27中异附加中间偃麦草染色体文库构建及抗病基因研究姓名：姜淑梅申请学位级别：博士专业：作物栽培学与耕作学指导教师：李文雄2003.6.1摘要本磺究利用染色体擞魏割、微克隐技术，建立小冰麦异附加系TAI·27中异附加中间僵麦革絷色俸文库。中搁燕麦革兵有撬瘸、抗莲等多耱特整，小球麦箨搿燕系TAI一27附加一对中间偃麦革染色体，具有大麦黄矮病抗性，抗瘸基因位于异附加中间偃麦革染色体上。本研究在染色体文滕建立的基础上，以克隆抗病纂因为目的进行丁一系列研究。据q用染色体微切割、徽克隆技术，采用微玻璃针法，

2、成功分离小冰麦异酣加系TAt一27中彝辩麴滟染色薅，懑避PCR扩灌获褥足够辩翔絷饿体DNA，戒珐锃建了瘁容爨托较大，对染色体的覆盖比较全的小冰麦髯附加系TAI．27中附加染色律的文库。该染色体文库的建立对于进一步建立这条染色体的高密度遗传连锁图谱，获得与菔要性状连锁的分子标记，进而分离重要基因及研究基因缎进化有重要意义。小冰麦异附加系TAI-27中异附加染色体麓戎功分离也免本磅究磊继王佟奠定了蹇葑蒺破。在小冰麦异拜}搬系TAI-27中异附热染色体文霹构建的基础上，蓠次利用同源杂交和抑制PCR原理，通过改避同源片段特异扩增技术(Hybrids

3、pecificamplification，HSA)，成功分离小冰麦异附加系TAI．27附加小染色体上的表达序列，建立一个快速分离特定染色体表达摩列的方法。试验涯明杂交特舅扩增(HSA)分离染色体eDNA是可行的。并虽由于经羯摹链cDNA可强大耀瘴{豪裁零，搽捧也更为麓馁。赣究霹分麓特定染色俸瓣表达序列标签(EST)及克隧新基因有重要参考价值。获得的染色体上袭达序列能为小澎抗性育种提供分子标记。同时进一步拓宽了染色体微分离、微切割与微克隆技术的应用。利用蚜虫饲咬小冰整异附加系TAI．27，接种大麦黄矮病病毒GAV株系，对接种大麦黄矮痪誊敬TA

4、I-27与难爨进行了差髯袭这戆疆究，巍隆到与困，}雾群麓耱这表透熬EST同源静帮剐，并进行了遗传背景分析和染色体定位。遮一结果对最终克隆和应用中间候麦草这对染色体上的抗性基因及分析TAI．27的抗性机制有重要意义。宥9个cDNA序列为TAI．27中酋次克隆(已在GenBank登记注册，注册号BQ788525．BQ788533)。投撼抗病基因保守的结构域设计镩势gl物，利雳PCR方法结合染毽体显微分离技术。瓿TAI*27中微分离的辫辩翻摹条染色镩及萁父母本中扩增到若干NBS痔到。经过与Genebank数据库进行核酸及氨基酸序列比较，得到的片段

5、与抗病基因或抗病基因间源序列同源，证明得到的片段为NBS(nucleotidebindingsite，NBS)类型的抗病基因同源片段(Resistancesgeneanalog，RGA)。对微分离的异附加单条染色体中获褥的一条RGA避行了Southern杂交襄Northern杂交努辑，缝莱证臻它往予TAI-27串来滚予孛惩僵麦鼙静辩热染色体上。这一结粟为克隆TAI-27中附加的中间僵爱蕈染色体上的R基因全长提供了特异性探针。小冰发TAI-27中辨附加染色体文库的构建是本研究的工作基础。本研究有助予进一步了解辩糖染色体上的逮砖售息，必最终获褥

6、醚麴的串润僵麦荤染色体上憋抗病基因及建立臻翻絷色体EST数攒艨羹定基硪。、／、_，。、r，／关键词染色体微切翻、微克磋技术；小冰麦髯附加系TAI-27；大麦簧矮瘸；表达序爹q标签：抗病蒸因同源序列。o／ⅧAbstractThinopyrumintermediigmpossessesthepropertiesofdiseaseresistance，droughtresistance，coldresistanceandotherstrictenvironmentalstresses．Wheat-Thinopyrumalienadditional

7、lineTAI．27createdbyhybridizationbetweencommonwheatandThinopyrumintermediumhasapairofchromosomesderivedfromThIntermediⅢ．TheadditionalchromosomesCalTytheresistantgenetoBYDV．Inthispaperseveralstrategieswereusedforresearchonresistantgeneslocatedontheadditionalchromosomes．First

8、ly．onealienadditionalchromosomewasisolatedandcollectedsuccessfullyunderaninvertedphasecon