《DNA突变技术》PPT课件

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1、第三章DNA突变技术基因突变包括单个碱基或片断的替换，基因片断的插入与删除等。根据其特点可将基因突变技术分两大类：1.位点特异性突变定点突变2.随机突变表型筛选随机突变易错PCR法(Error-pronePCR)降低一种dNTP的量（降至5％-10％）加入dITP来代替被减少的dNTP缓冲液中另加0.5mmol/LMn2+DNAShuffling外显子、单基因和基因家族的重组装随机引物延伸法交错延伸法定点突变点突变——碱基删除、增补和替换易错PCR(epPCR)HowDNAshufflingisdoneinth

2、etubeRandomfragmentationofapoolofrelatedgenes;Self-primingpolymerasereactionandtemplateswitching(causingcrossovers);PCRamplificationwithprimersofreassembledproductsHowDNAshufflingworksHowDNAshufflingworks？Similarmutantsgeneratedbyerror-pronePCR,randomandsite

3、-directedmutagenesis...........SinglegeneshufflinglibraryofpointmutantsFamilygeneshufflinglibraryofchimerasGeneratingchimeraswithcrossoversoflargeblocksofsequences一、单基因和基因家族的重组装XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXFragmentReasse

4、mbleSelectbestwithDNAseIfragmentsrecombinantsRepeatformultiplecyclesHowDNAshufflingworks？一、单基因和基因家族的重组装DNA重组装的过程磷脂酶热稳定－催化活性的分子进化（JaeKwangSong等，2000）β-葡糖苷酶耐热性的提高(Marý´aJesu´sArrizubieta等，2000）耐热p-硝基苯酯酶的分子进化(LoriGiver等，1998）Thefucosidaseactivityareshownwithsti

5、ckrepresentation.Twomutationsintheactivesite(Asp604andGln573)areshowninred.Twomutationsincloseproximityoftheactivesite(Pro511andAsp908)areshowninmagenta.Twomutationsfarawayfromtheactivesiteandontheproteinsurface(Val9andGln135)areshowningreen.Therestofthesubs

6、tratebindingandactivesiteresiduesareshowninyellow..牛乳糖酶到岩藻糖苷酶的直接进化（JI-HUZHANG等，1997）二、随机引物PCR(RPR)和重组装HowDNAshufflingworks？多功能氧化酶的定向进化（HikaruSuenaga等,2001）三、交错延伸PCR突变法(StEP)HowDNAshufflingworks？枯草杆菌蛋白酶E热稳定性的分子进化（HuiminZhao等，1999）进化的热稳定性枯草芽孢杆菌蛋白酶E的突变谱系进化后的枯草杆

7、菌蛋白酶E正面反面芽孢杆菌脲酸酶的定向进化（Su-HuaHuang等,2004）定点突变的研究意义1.对调控区进行突变研究基因结构与功能之间的关系2.对编码基因进行突变检验特定残基在蛋白质结构、催化活性和配基结合能力中的作用获得突变蛋白定点突变的类型寡核苷酸介导的基因突变指用含有突变碱基的寡聚核苷酸片断作为引物，在聚合酶的作用下启动DNA分子进行复制。盒式突变是利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列。PCR介导的基因突变DNA定点突变的种类寡聚核苷酸介导替换、插入、删除盒式突

8、变PCR介导寡聚核苷酸介导法在dut+的E.coli中dUTPdUMP在dUTP酶缺失体中（dut-）dUTPdUMPdUTP酶dut：dUTPase突变，可导致E.coli内dUTP的量增加，当DNA复制时，可在很多应该加dTTP的位置加入dUTP。在正常情况下，尿嘧啶-Ｎ-糖基化酶(ung+)可以去除掺入DNA中的尿嘧啶残基。但在ung-的菌株中，此酶失活。在大肠杆菌dut-ung