玉米花期干旱胁迫下诱导基因的分离和功能分析

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1、-11108340分类号：密级：单位代码：10019学号：B030411·，田芦茗式粤博士学位论文玉米花期干旱胁迫下诱导基因的分离和功能分析IsolationandFunctionAnalysisofDroughtStressInducedGenesatthenoweringStageiIlMaKe但动mays)研究生：奎会豆指导教师：至丞主班究旦合作指导教师：鍪．揸研究虽王国篡熬援申请学位类别：理堂擅士专业领域名称：遗焦堂研究方向：撞物基固互猩所在学院：生物堂院．2007年4月摘要乐米是全球重要的粮、饲兼川作物，也是重要的能源作物，在粮食安

2、全、能源安全等方面起着非常重要的作川。随着全球性水资源的匮乏和玉米种植面积的不断扩人，T早愈加成为玉米生产的发艘的lj艮制1”素。我国有半以卜^的玉米受到干旱的威胁，尤其是在玉米花期，干旱胁迫往往会造成败育和严重减产。但是，由丁对玉米抗早机制，特别是对其开化期抗旱的遗传机制、对T早胁迫的效应研究较少，极人地限制着在向‘种手段与育种材料方面取得突破。本研究以抗早性强的玉米自交系CNl65作为实验材料，通过采H】抑制差减杂交(SSH)方法构建eDNA文库，分离玉米雌穗和花丝T早胁迫下差异表达的基冈，建立玉米花期干旱胁迫F雌穗雨J花丝诱导基冈表达谱

3、，解析玉米花刺抗旱的分f机理，旨在为玉米抗早育种及相关研究奠定新的理沦内秤。本研究构建的eDNA文库包含1920个M『性克隆，经过PCR验证后测序发现，1439条EST是有效序列，聚类分析得到361条uniESTs，BLASTX分析表明，有218条uniESTs和数据库中的蛋白序列钉较高的相似性。99条uniESTs和数据库中的核酸序列有较高的相似性，但是找小到匹配的蛋白序列，还有44条uniESTs在GenBank数据库中既没有相似的核酸序列也没仃相似的蛋白序列。218个已知功能的基因按照拟南芥功能基㈨组分类的方法可以分为13类，其巾，与代

4、谢相关的基冈rLl27％，与蛋白质合成相关的基罔^16％，与蛋白质加T相关的基冈占10％，与转录相关的基因lIJ10％，与细胞发育周期相关的基陋l占9％。采用cDNAMacroarray的方法对获得的uniESTs进行分析，结果表明：160个uniESTs个神：雌穗中是上调表达的，129个uniESTs在花丝中是上调表达的．125个uniESTs在雌穗和花丝都是上调表达的。为了验证cDNAMacroarray结果的可靠性，采用实时定量PCR(Real—timequantitativePCR)力法刘cDNA文J：车中的10个uniESTs进行了

5、分析，结果表明两种方法获得的基冈表达量姓不完全、致的，但基冈的表达模式相同，说明利用cDNAMacroarray对cDNA文库中分离到的基岗进行发达谱的分析是可行的。在这个cDNA文库中发现了一个和来源丁水稻与拟南芥ERD4基因相似性很I岛的uniEST，这个uniEST在干旱胁迫r的雌穗和花丝中都上调表达的。采爿j5'-RACE和3'-RACE的力法得到丁这个uniEST的cDNA全长，命名为ZmERD4。ZmERD4包含2073个bp，其中1776bp的开放蒯读框，8bp的5'-UTR和289bp的3"-UTR。Southernblot结

6、果表明ZmERD4在玉米基吲组中含有一个拷儿。RNAgelblot结果表明ZmERD4受干。1‘胁迫、高盐胁迫和ABA的诱导表达，但是小受低温(4℃)胁迫诱导表达。弧细胞定位结果表明ZmERD4在细胞核中特异表达；ZmERD4编码蛋白_二级结构分析显示它是包含1个信号肽和7个跨膜区的整合膜蛋向；ZmERD4推导的氨基酸序列共具有8个蛋闩激酶C磷酸化位点(ProteinkinaseCphosphorylationsite)，14个酪蛋白激酶II磷酸化位点(Caseinkinase11phosphorylationsite)和3个1‘四烷基化位点

7、(N—myristoylationsitc)。由J‘蛋向激酶C和酪蛋F1激酶TI在细胞周期凋节和信号转导方面有重要的作用，冈此推断ZmERD4可能在细胞信号转导方面受蛋白激酶C和酪蛋白激酶II的调摔；在逆境胁迫r，N—terminalmyristoylation在膜靶和信号传导力【莳巳着重要的作用。这种修饰在蛋白对膜的咀及蛋白之问的相互作用方面是必要的。_L}jZmERD4转化拟南芥，T3代转基冈机株在耐早、抗盐方面明显高丁对照植株，这表明ZmERD4神划．牛物胁迫反应中起着重要的作川。关键词：玉米，下早胁迫，抑制差减杂交，基闪表达，基冈克隆

8、IIAbstractDroughisoneofthemostimportantlimitingfactorsforagriculturalproductioninm