桂枝茯苓胶囊治疗原发性痛经的物质基础及作用机理研究

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1、南京中医药大学博士学位论文桂枝茯苓胶囊治疗原发性痛经的物质基础及作用机理研究姓名：王振中申请学位级别：博士专业：中药学指导教师：段金廒20090601摘要桂枝茯苓胶囊由桂枝、茯苓、桃仁、白芍、牡丹皮组成，处方源于张仲景《金匮要略》桂枝茯苓丸，为治疗妇科血瘀证的经典名方。具有活血化瘀、缓消症块、去瘀生新、理气止痛之功效，临床用于治疗子宫肌瘤、慢性盆腔炎、痛经、卵巢囊肿等妇科疾病，疗效确切，但其物质基础及作用机制研究相对较少。本研究试图通过化学分离结合效应评价的方式，采用从整体动物到细胞及分子的多种模型，从不同角度阐释桂枝茯苓胶囊治

2、疗原发性痛经的物质基础及作用机制。一、桂枝茯苓胶囊治疗原发性痛经的物质基础研究1．桂枝茯苓胶囊提取与各部位的分离本研究对胶囊内容物进行提取，不同极性溶剂萃取分离及大孔树脂吸附梯度洗脱两种分离方案，将全方分为挥发油部位、石油醚萃取部位、乙酸乙酯萃取部位、正丁醇萃取部位、水提部位；大孔树脂水洗脱部位、20％乙醇洗脱部位、40％乙醇洗脱部位、60％乙醇沈脱部位、95％乙醇洗脱部位，并针对各部位成分的特点建立了相应的指纹图谱。2．桂枝茯苓胶囊不同分离部位活性评价本研究通过小鼠离体子宫收缩模型，对桂枝茯苓胶囊各部位样品进行了活性评价。结果

3、显示：挥发油部位，乙酸乙酯萃取部位，大孔树脂40％乙醇洗脱部位，60％乙醇洗脱部位均表现出抑制活性。卵巢颗粒细胞增殖模型结果显示：正丁醇部位及大孔树脂60％乙醇洗脱部位均具有显著的促进大鼠卵巢颗粒细胞增殖的作用。巨噬细胞释放NO模型结果显示：挥发油及大孔树脂60％乙醇洗脱部位能明显抑制腹腔巨噬细胞分泌NO。3．桂枝茯苓胶囊活性部位的成分分析效应评价研究结果表明，桂枝茯苓胶囊挥发性部位，大孔树脂40％乙醇洗脱部位、60％乙醇洗脱部位均存在效应物质，因此对这些有效部位进行了进一步化学成分分析鉴定。GC．MS分析结果表明：挥发油部位主

4、要成分为桂皮醛，肉桂酸，丹皮酚。LC．MS分析大孔树脂40％乙醇洗脱部位、60％乙醇洗脱部位结果表明：其主要成分为没食子酸、l，2，3，4，6-0．五没食子酰葡萄糖，苦杏仁苷，芍药苷，芍药内酯苷，芍药新苷等。4．效应部位中各成分的活性验证根据上述研究结果，对已鉴定的化合物进行了活性验证。证实桂皮醛、芍药苷等具有抑Nd,鼠离体子宫原发性痛经模型收缩的活性；没食子酸、芍药苷、肉桂酸、桂皮醛、苦杏仁苷、苯甲酸能明显抑制卵巢颗粒细胞增殖，1，2，3，4，6．O．没食子酰葡萄糖能明显促进卵巢颗粒细胞增殖：丹皮酚、芍药苷、芍药新苷、苦杏仁苷

5、、苯甲酸能明显抑制大鼠腹腔巨噬细胞过度分泌NO。二、桂枝茯苓胶囊治疗原发性痛经的机制研究1．桂皮醛抑制小鼠离体子宫痛经模型收缩的机制研究本研究通过考察桂皮醛对各种子宫平滑肌激动剂及KCI诱导的子宫平滑肌的影响，初步确定了其作用机制是通过抑制细胞夕l-Ca2+内流及细胞内Ca2+库的释放，而对于去极化引起的细胞；,l,Ca2+内流无明显影响；同时应用荧光酶标仪考察了桂皮醛对平滑肌氧化应激产生的痉挛的影响，结果显示桂皮醛能部分拮抗并抑制细胞内Ca2+浓度提高。2．桂皮醛、芍药苷对凝血酶诱导子宫平滑肌细胞增生的影响本研究通过考察桂皮醛

6、、芍药苷对凝血酶诱导子宫平滑肌细胞增生的影响，发现桂皮醛、芍药苷具有明显抑制凝血酶诱导的平滑肌增生作用。3．桂皮醛、芍药苷对子宫平滑肌损伤的保护作用本研究建立了子宫平滑肌的氧化损伤及低温损伤模型，考察桂皮醛、芍药苷对损伤平滑肌增殖的影响。结果发现桂皮醛、芍药苷能显著促进平滑肌增殖并减少活性氧诱导的平滑肌细胞凋亡。4．有效部位中不同成分配伍对活性的影响本研究以桂皮醛、芍药苷为主要成分，考察它们与其他成分配伍后对活性影响。结果显示：芍药苷能提高桂皮醛抑制小鼠离体子宫收缩效应，苯甲酰芍药苷能明显提高芍药苷抑制小鼠离体子宫收缩效应，显示

7、具协同作用。三、桂枝茯苓胶囊效应成分的药代动力学研究根据以上研究结果及已有实验基础，选择建立了苦杏仁苷、芍药内酯苷、芍药苷的HPLC．MS／MS测定方法，并对其在比格犬体内的药物代谢特征进行了研究。结果显示，三者在体内的代谢均可用开放二室模型来描述，不同给药剂量下苦杏仁苷在比格犬体内的平均半衰期分别为2．43h，1．32h，芍药内酯苷的平均半衰期分别为6．16h，5．91h，芍药苷的平均半衰期分别为4．33h，3．62h，提示苦杏仁苷在体内消除较快，平均滞留时间较短，芍药内酯苷与芍药苷消除速率中在盘守。关键词：桂枝茯苓胶囊；原发

8、性痛经；生物效应；物质基础；作用机制；药代动力学ABSTRACTGuizlli·-Fulin·-Capsuleisonerepresentativeofthefamousprescriptionsderivedfrom”JinguiYaolue”(”Synops