粗糙脉孢菌AS31602乙醇发酵的代谢研究

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1、山东大学博士学位论文粗糙脉孢菌AS3.1602乙醇发酵的代谢研究姓名：张志华申请学位级别：博士专业：微生物学指导教师：曲音波20070520山东大学博士学位论文粗糙脉孢菌AS3．1602乙醇发酵的代谢研究摘要石油、煤炭等矿产资源是当莳最主要的能源物质和化工原料。随着历史的进程，它们失去了再生的条件，大量消耗必将导致快速枯竭。以石油等不可再生资源为基础的现代工业化社会的发展模式是难以持续的。寻找可再生的替代能源和化工原料，特别是新的液态燃料，已成为维持人类社会可持续发展的紧迫任务。我国纤维素类可再生资源丰富，仅每年生成的农作物秸秆就达6亿多吨。若能采用适宜的技术

2、将这些废物加以转化利用，不仅能够节粮、代粮，缓解能源紧缺，同时还可以保护环境，对我国经济的可持续发展将产生深远的影响。乙醇是来自可再生资源的最有发展前景的液体燃料，但目前生物法生产的乙醇主要来自糖类和淀粉，面对世界人口的急剧膨胀和粮食短缺，用粮食生产乙醇的发展将受到限制。近三十年来，在国际能源组织(InternationalEnergyAgency)和各国政府的帮助下，各国科学家共同致力于利用植物纤维资源制取燃料乙醇的研究和开发工作，在原料预处理、菌种筛选与选育、纤维素酶制备和酶水解技术、乙醇发酵技术等方面取得了令人瞩目的进展，部分技术已进行了中试规模的研究。

3、但由于经济和技术上的原因，目前利用植物纤维资源转化乙醇的技术仍未完善，还有待于进一步的研究。其关键难点之一在于如何进一步简化工艺路线，降低生产成本。粳糙脉孢菌(Neurosporacrassa)AS3．1602具有同时产生纤维素酶、半纤维素酶、发酵葡萄糖和木糖的能力，这就为我们在同一个生物反应器中，利用同一种微生物完成生物质转化为乙醇所需的酶制备、酶水解及多种糖类的乙醇发酵等全过程，从而简化工艺，降低成本，提供了可能。此方法称为微生物直接转化法或一步法(directmicrobialconversion或consolidatedbioprocessing)，被

4、认为具有良好的发展前景。本论文的主要研究目的是从纤维性物质全利用的角度出发，探讨粗糙脉孢菌一步发酵生物质生产燃料乙醇过程中，糖酵解、磷酸戊糖途径和三羧酸循环机制、粗糙脉孢菌AS3．1602乙醇发酵的代谢研究细胞代谢状态、乙醇发酵的主要控制因素等，为充分而有效的利用纤维性可再生资源生产乙醇提供可靠的实验数据和理论依椐。本论文的主要研究结果如下：一、建立了McrassaAS3．1602胞内代谢物的抽提和检测方法采用甲醇法猝灭代谢反应并抽提胞内代谢物，分别用真空浓缩和固相萃取法对样品进行处理，并对固相萃取体系进行了优化。分别建立了有机酸和磷酸化糖的离子色谱检测方法，

5、为ⅣcFassa的代谢研究建立了分析基础。二、分别对脱cra$saAS3．1602的葡萄糖乙醇发酵、木糖乙醇发酵、葡萄糖和木糖混合乙醇发酵以及纤维素直接转化产乙醇的过程进行了代谢研究分析工作在三个层面上展开，具体包括胞外代谢物浓度、胞内代谢物浓度和胞内关键酶酶活的分析，并结合代谢通量分析等手段，获得了对ⅣcrassaAS3．1602乙醇发酵代谢特征的全面认识。1．凡cYassaAs3．1602葡萄糖乙醇发酵代谢研究在本实验室前期的菌种筛选及ⅣcrassaAS3．1602的纤维素酶生产能力研究的基础上，对ⅣcrassaAS3．1602葡萄糖乙醇发酵的代谢特征进行

6、了研究，通过与传统的乙醇发酵工业菌株SaccharomycescerevisiaeNAN27在胞外代谢物和胞内酶活水平上的比较，揭示了Ⅳcra$$oAS3．1602在葡萄糖乙醇发酵方面存在的问题，为菌株的改造提供了前提。ⅣcrassaAS3．1602葡萄糖乙醇发酵的主要限制因素是乙醇对发酵的抑制，当发酵液中的乙醇浓度超过2．0％(vⅣ)时，胞内相关酶的活性和胞内代谢物的水平就显著降低，菌丝浓度也有一定下降。2．iV．cYa$$aAS3．1602木糖乙醇发酵代谢研究研究了氧限制对ⅣcrassaAS3．1602木糖发酵的影响，并进行了代谢通量分析。随着氧限制程度的

7、提高，木糖利用速率和菌体生长速率不断降低。通氧量对乙醇的产生也有显著的影响，乙醇生成的代谢流速随着氧传递速率(oxygentransferrate，oTR)的变化不断改变。当OTR为8．4mmol／L-h时，乙醇的产生速率和终浓度都达到最大值。绝大多数胞内代谢中间物的浓度随着氧限制程度的¨山东大学博上学位论文提高不断降低。木糖代谢的前三个酶，木糖还原酶(xylosereductase，XR)、木糖醇脱氢酶(xylitoldehydrogenase，XDH)和木酮糖激酶(xylulokinase，XK)的酶活随着氧限制程度的提高不断降低，导致木糖利用速率的降低。

8、当OTR在肚12．6mmol／L·h范