酵素抗体多重染色法

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1、酵素抗体多重染色法神戸大学医学部附属病院病理部先端組織染色センター柳田絵美衣はじめに免疫組織化学や免疫細胞化学（以下「免疫染色」）は病理診断において重要な役割を果たしている。免疫染色は多くの技術的改良がなされ、現在では多種多様な手法や応用法が存在する。その中でも多重免疫染色法は同一切片・同一細胞上で複数の抗原局在を同時に検出することにより、それらの相互関係の観察・証明が可能となる応用法のひとつである。代表的な多重免疫染色法には蛍光抗体多重染色法と酵素抗体多重染色法がある。前者は研究の場で幅広く用いら

2、れ、染色工程は少なく手技的にシンプルである。しかし、診断病理の現場ではあまり用いられてはいない。その理由として暗視野顕微鏡での観察が必須であり組織構築の確認が困難であることが考えられる。それに対して酵素抗体多重染色法は、明視野顕微鏡での観察が可能であるため、組織構築の観察・確認が容易である。しかし、蛍光抗体法とは異なり電子的なマージが困難であり、対象とする複数の抗原の局在が同一部位または近接している場合には、共発現の評価が困難となる。さらに、手技が煩雑で所要時間も長いことから、酵素抗体多重染色法も診

3、断現場では敬遠されてきた。しかしながら、近年ではカクテル抗体を用いた染色方法の登場や自動化が進み、シンプルな手技でかつ短時間の染色が可能となったため、酵素抗体多重染色法も診断の現場に応用しやすくなってきている。酵素抗体法では二次抗体の標識に用いる酵素は主にペルオキシダーゼ（peroxidase：PO）とアルカリフォスファターゼ（alkalinephosphatase：AP）である。使用する酵素により発色剤が異なる。茶色、赤色、青色、黄色や黒色など多様な色調の発色剤が登場しており、原理的には何重もの染

4、色が可能である。本稿では、病理学検査で主流である間接法による多重染色技術について解説する。1.基本法従来からある基本的な方法は、抗原抗体反応を単一の標本に複数回重ねて行う方法である。例えば、抗原Xと抗原Yを証明する場合、まず１染色目に抗X抗体を用いて通常通りの免疫染色をおこなう。次に、抗Y抗体を用いて、免疫染色を同一標本上に重ねる。1染色目の後に、抗原抗体複合物の除去や残存する抗体の解離を目的とした洗浄操作、残存する抗体や酵素の失活を目的とした加熱操作が必要となる場合が多い（表1、模式図1）。しかし

5、、これらの操作や、１染色目での抗原賦活化処理が、2染色目の対象抗原の抗原決定基を破壊し、染色不良となる場合がある。また、単染色と比べ、ほぼ倍の工程を要することとなり、ルーチン業務には適した方法ではない。そのため、2種類の抗原に対して、マウスとウサギといった異なる動物種の抗体を用意できる場合は後述するカクテル法が望ましい。基本法の染色例として2例紹介する。-1-表1：酵素抗体多重染色法基本法1.脱パラフィン、流水水洗2.抗原賦活化処理（必要に応じて施行）3.流水水洗4.内因性ペルオキシダーゼ活性阻止室

6、温10～30分5.洗浄TBS6.一次抗体反応抗X抗体室温30～60分7.洗浄TBS8.二次抗体反応酵素標識抗IgG抗体室温30分9.洗浄TBS10.発色（標識酵素に対応した発色剤を使用）11.流水水洗12.抗体失活・洗浄かつ抗原賦活化処理13.流水水洗14.一次抗体抗Y抗体室温30～60分15.洗浄TBS16.二次抗体酵素標識抗IgG抗体室温30分17.洗浄TBS18.発色（標識酵素に対応した発色剤を使用）19.流水水洗20.カウンター染色（使用した発色剤の色調により染色を選択）21.流水水洗22.

7、色出し23.流水水洗24.封入模式図1：基本法原理-2-①劇症肝炎の治癒過程における細胆管からの肝細胞再生像を挙げる。HE染色像ではロゼット様の形態が観察され（図1a）、Cytokeratin7とHepatocyteの各単染色では図1b、図1cのような像となる。これらの像からは、何が起きているのかを把握し組織を読み取ることは困難である。そこで抗Cytokeratin7マウスモノクローナル抗体（OV-TL12/30）と抗Hepatocyteマウスモノクローナル抗体（OCH1E5）の二重染色をおこなう。

8、染色プロトコールは表１に準じる。１染色目の二次抗体はPOを標識した抗マウスIgG抗体（ヒストファインシンプルステインMAX-PO(M)）を用い、Cytokeratin7をPO系発色剤であるDABで茶色に発色した。2染色目ではAPを標識した抗マウスIgG抗体（ヒストファインシンプルステインAP(M)）を用い、HepatocyteをAP系発色剤のPermaBlue（Blue）で青色に発色させた。1染色目と2染色目の間には加熱処理を行った。染色結果は図1dに示す。増殖した細