致命鹅膏菌丝体人工培养及毒素检测

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1、湖南农业大学博士学位论文致命鹅膏菌丝体人工培养及毒素检测姓名：张平申请学位级别：博士专业：植物学指导教师：张志光;杨祝良20040501致命鹅膏菌丝体人工培养及毒素检测摘要鹅膏属是一个世界性分布的大属，目前已定名的约有500种。该属中有一些种类有剧毒，世界上大多数蘑菇中毒死人事故都是由鹅膏菌引起的。鹅膏菌所含环肽毒索共有3大类22种。其中的c【．a【【lanitin是RNA聚合酶II的专一性抑制剂；phalloidin能与细胞内的丝状肌动蛋白(F—actin)特异性结合。鹅膏毒素在生命科学研究领域有重要用途。由

2、于鹅膏菌绝大多数为外生菌根菌，与高等植物形成共生关系，因此很难进行人工培养。目前科研所需鹅膏毒素只能从野外采集的予实体中提取，由于野生资源相当有限，鹅膏毒素价格十分昂贵。致命鹅膏是2000年在我国广东省发现的一个鹅膏菌新种，它是一种剧毒蘑菇，已导致18人中毒死亡。但有关此种的生物学特性、菌种分离、人工培养及菌丝体中毒素检测未见任何报道。本研究通过野外调查、显微及电镜观察，系统研究了致命鹅膏的生物学特性，首次报道了其核相变化及担孢予次生壁形成的原因；用组织分离的方法成功获得其菌种并进行了扩大培养；用分子生物学方法

3、对所得到的纯培养物进行了鉴定：用高效液相色谱、质谱、核磁共振、小白鼠毒性试验等方法对菌丝体中所含鹅膏毒素种类及含量进行了检测，发现其毒素含量较高，首次实现了从人工培养的菌丝体中提取鹅膏毒素。具体研究结果如下：1、生物学特性研究：1)致命鹅膏目前仅在中国广东省发现，它与山毛榉科的黧蒴栲形成外生菌根。每年3月至4月发生子实体，子实体白色，具菌环和菌托。2)多数担子生有两个担子小梗，少数生～个担子小梗，担孢子(9，0)9．5～12．O(14．5)×(8．5)9．0～11．5(13．O)¨m。双孢担子产生的担孢予具有4

4、个细胞核，单孢担子产生的担孢子具有8个细胞核。3)担孢子成熟时只有一层薄壁，在适宜的条件下可在原有细胞壁之内再形成一层较厚的次生壁。适宜的湿度和温度是次生壁形成的必要条件。2、菌丝体的人工培养：1)运用组织法和孢子法分离致命鹅膏的菌种，结果只有组织法成功。从子实体不同部位取下的组织块均能长出菌丝，尤以幼嫩的菌褶分离效果最好。2)采用PDA、改良PDA、PDM、改良PDM、MMN、M一76六种不同的培养基培养致命鹅膏菌丝体，结果在改良PDM培养基上生长最好。固体培养比液体培养产量高。培养到70天时菌丝体产量达到最

5、大值。3)致命鹅膏菌丝体生长的最适温度在25。c；最适pH值为5．O：在PDM培养基中添加209／1000m1的葡萄糖对菌丝体生长最为适宜。4)人工培养的菌丝多数为双核菌丝，偶见三核或四核菌丝。生长前期菌丝丝状，粗2．5～4”m，单个细胞长40120“m；生长后期节间变短，膨大为近球状，直径达30“m以上。3、菌丝体的分子生物学鉴定：1)用cTAB法分别提取致命鹅膏子实体和菌丝体的基因组DNA。用引物ITs4、ITs5进行PCR扩增，测序得到子实体和菌丝体的ITS序列，结果表明二者的ITS序列完全相同。说明分离

6、到的菌丝体确实是致命鹅膏的菌种。2)通过与同属的其它真菌比较，致命鹅膏的ITs序列与另外两个白色剧毒鹅膏——鳞柄鹅膏(一v打md)和双孢鹅膏(爿．6￡驴0，堙M)同源性虽高，与鳞柄鹅膏的相似性为91％，与双孢鹅膏的相似性为89％。4、菌丝体中肽类毒素的检测1)运用HPLc分离菌丝体中的肽类毒素，得到4个组分，其中1号组分的保留时间与6一amanitin标样相同，2号组分的保留时间与缸一amanitin标样相同。2)将HPLc收集到的l号组分和2号组分进行质谱分析，结果1号组分的分子量为919．5Da，与文献中6

7、．amaIlitin的分子量相同；2号组分的分子量为918．4Da，与文献中d—amanitin的分子量相同。3)经‘H—NMR、“C—NMR解析鉴定l号组分为B．锄aflitin，2号组分为a—a111anitin。4)用致命鹅膏菌丝体粗毒液对小白鼠进行腹腔注射，LDso(半致死量)为14．629干重，kg小鼠，从菌丝体中提取的a．锄aIlitin精毒LD50为O．62mg，kg小鼠。5)致命鹅膏菌丝体中肽类毒素含量随培养时间延长而增加，液体摇床培养的菌丝中B．砌anitin含量比固体培养的菌丝明显要高，a．

8、amanitin含量与固体培养的菌丝相近。关键词：致命鹅膏菌丝体人工培养ITs序列肽类毒素PureCultureandToxinDeterminationoftheMyceliaof爿，"n，l豇仃Exf打n凰AbstractThegenus爿冲2“门f船isoneofthelargestbasidiomyceousgenerawithabout500taxadescribedworl