胚胎成纤维细胞支持的分化抑制培养体系对脐血造血细胞扩增的实验研究

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1、华中科技大学同济医学院博士学位论文第一部分胚胎成纤维细胞支持的分化抑制培养体系对脐血造血细胞扩增的实验研究前言二十世纪是生命科学发展最为迅速的时代，其中最引人注目是干细胞研究领域。1998年，美国两家实验室分别报道来源于人囊胚内胚团细胞群和生殖峭的多能千细胞系，这是人类发育生物学研究的重大技术突破。由于干细胞研究所具有的巨大基础医学与临床医学价值，在99年末的年度世界十大科技成果评选中“干细胞研究的新发现”荣登榜首。胚胎干细胞(embryonicstemcells,ES)是从内细胞团或原生殖靖细胞获得的具有自我更新，高度增殖的多潜能细胞，在体外易向终末细胞分化，

2、其生长条件极为苛刻。胚胎干细胞系的分离与建系成功，除有赖于选择适宜的具有全能性的细胞或细胞团外，其核心培养技术为分化抑制培养体系的建立。近年以来自体和异基因造血干细胞移植(hematopoieticstemcelltransplantation,HSCT)已广泛用于遗传性疾病，肿瘤性疾病和先天性疾病的治疗，进一步拓宽其临床应用领域需要有够数量的具有快速稳定植入能力的造血干细胞。为了满足这种需求，人们在研究干细胞生物学特征时也探讨了人干细胞在体外扩增的可行性，证实体外扩增造血干细胞这一目的是有希望实现的。体外扩增造血干细胞对那些可供移植的干细胞数量有限的情形，如脐

3、血HSCT，多次化疗后的autoHSCT十分重要。脐血(cordblood,CB)作为造血干细胞的来源之一是源于脐血造血细胞本身具有的一些优势:1)脐血易获取，对供体没有损伤，也无任何伦理学问题。2)CB-HSC的端粒长且分裂次数少，具有更强的增殖潜力和更长华中科技大学同济医学院博士学位论文的造血维持时间。3)脐血移植传播感染性疾病的风险较小。4)同骨髓移植相E匕其急慢性GVHD(graftversushostdisease)的风险和强度较小，同时允许较大程度的HL人不合的供受体移植。因此脐血移植对某些需要异基因移植的病人可能是最佳选择，如儿童患者或少数民族患者

4、。但是由于一份脐血所采集的HSC数量有限，限制了CB-HSCT的临床应用。CB-HSC还是一种理想的基因治疗靶细胞，但大部分基因治疗过程需要借助于扩增体系驱使干细胞进入细胞周期，才能使病毒载体与干细胞发生整合。脐血移植后造血重建和免疫重建较骨髓移植(Bonemarrowtransplantation,BMT)和外周血造血干细胞植移植(peripheralbloodstemcellstransplantation,PBSCT)缓慢，实际应用中需要更加符合临床的脐血移植物。良好的扩增培养体系能使脐血的治疗价值进一步提高。脐血造血细胞的扩增应达到两个目的，一方面具有永

5、久造血支持作用的HSC数量的扩增和特性维持，另一方面是通过体外扩增获得早期植入的造血祖细胞.经过多年的努力，人们在体外扩增体系的建立方面取得了长足的进展，证实基质支持的扩增培养体系有助于脐血造血干细胞的自我更新和特性维持.早期造血因子SCF(干细胞因子，stemcellfactor),FL(flt3ligand),LIF(白血病抑制因子leukemiainhibitoryfactor)和TPO(血小板生成素thrombopoitein,),EPO(红细胞生成素,erythropoietein)有助于脐血干祖细胞的增殖和分化，而中晚期造血因子G-CSF(granu

6、nocyte-colonestimulatingfactor,粒细胞集落刺激因子，)GM-CSF(granuno-macrophage-colonestimulatingfactor,粒巨噬细胞集落刺激因子)，IL},IL6Onterleukin3,6白细胞介素3,6)则促进祖细胞增殖分化。研究还发现无基质扩增养体系可导致扩增细胞表型漂移(phenotypemigration),扩增后脐血千细胞重建能力、植入水平和归巢能力下降，扩增移植物干细胞耗竭。分化抑制因子LIF在无基质培养体系中协助IL。或单独诱导HSC华中科技大学同济医学院博士学位论文凋亡，但在基质培养

7、扩增体系中上调基质细胞扩增刺激因子(stemcellsexpansionpromotingfactor)，下调基质细胞扩增抑制因子(stemcellsexpansioninhibitoryfactor)，并具有抗HSC凋亡的作用，能促进干细胞自我更新并抑制其分化，是造血干细胞扩增培养体系中重要的细胞因子之一。作为成体千细胞(adultsomaticstemcell)或组织特异性干细胞(tissuespecifiedstemcell),HSC是胚胎干细胞体内体外分化的中间产物之一，具有与胚胎干细胞相似的自我更新能力及多系分化潜能。唯其分化仅局限于血液细胞和免疫细胞

8、，在造血系统疾病的治疗、