稻瘟病菌单克隆抗体的研制及其对稻瘟病菌附着胞形成的影响

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1、!"卷#期微生物学报&’()!"0’)#$"""年%$月!"#$%&"’()&(*(+&"$,&-&"$*+,+-.+/$"""!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!稻瘟病菌单克隆抗体的研制及其对稻瘟病菌附着胞形成的影响"吴建祥林福呈李德葆陈正贤娄沂春（浙江大学生物技术研究所杭州1%""$2）摘要：稻温病菌的分生孢子、芽管、附着胞的混合物作为抗原免疫7897／,小鼠，取免疫小鼠的脾细胞与:;$／"骨髓瘤细胞在<"=;>?下融合成杂交瘤细胞，用间接>9@:8筛选阳性孔

2、，获%%株单克隆抗体。间接免疫荧光试验表明其中!株单克隆抗体$7、!8、%*和$A!%%!分别与孢子、芽管或附着胞有特异性结合；B+CD+/E.(’DDFEG分析发现$7、!8、%*单克隆抗!%%体分别与孢子、芽管表面的提取物有不同的结合带；此四株单克隆抗体均干扰稻温病菌附着胞形成，并抑制稻温病菌在叶表的致病性。关键词：稻瘟病菌附着胞，单克隆抗体，间接免疫荧光试验中图分类号：:!1<)%%文献标识码：8文章编号："""%6#$"2（$"""）"#6"#146!<稻温病是水稻的毁灭性病害，世界上几乎栽培水稻的地区都有此病发生。据英联

3、邦真菌学协会（HI@*FCD/F.JDF’EIKLC’M;(KED*FC+KC+C，<%，#+N，%24%）统计，世界上4<个国家都有此病的危害。日本尽管广泛地使用了化学杀菌剂，但%2<1年至%2#"年间，平均年损失仍占总产$O24=［%］。在印度，%2#"年至%2#$年间，由于稻温病流行，造成$##P"""吨产量损失，占总产"O4=［$］。在菲律宾，稻瘟病流行地区上万公顷水稻遭受其害，产量损失超过<"=［1］。进入4"年代，由于抗病品种选育，合理栽培措施以及采用有效的杀菌剂，我国稻瘟病发生的面积及产量的损失有明显的降低，但是在%

4、24!年至%24<年间我国稻瘟病仍然流行，造成的产量损失为"O3=!"O4=［!］。稻瘟病菌以菌丝体和分生孢子在病稻草和病谷上越冬，病稻草和病谷是翌年病害初次侵染的主要来源。至第二年当气温回升到$"Q左右时，若遇降雨，就能不断地产生分生孢子。孢子的产生和传播以夜间%$时至次晨#时为最多［1］。当稻瘟病菌接触稻株后，在适宜湿度条件下发生如下的侵染过程：（%）病菌的分生孢子接触寄主表皮上的机动细胞后，其尖端泄放的粘胶［<］以及发芽使得孢子紧密地粘着在寄主表面；（$）芽管继而分化成特别的侵染机构，叫附着胞［#］；（1）附着胞产生侵染栓穿

5、透角质层和表皮细胞壁；（!）病菌分化成次生菌丝在寄主细胞中生长，侵染邻近表皮细胞并能深入叶肉细胞；（<）<63N后出现症状，分生孢子梗上分化出大量的新的分生孢子并从病斑中释放出来；（#）这些新形成的分生孢子可重新侵染寄主。在生长期即以菌丝体和分生孢子在病稻草、病谷上越冬，完成侵染循环。其中附着胞形成是病菌成功侵入寄主完成整个侵染循环的关键步骤之一。因此，我们开展了稻瘟病菌附着胞形成机理的研究。为了分析稻瘟病菌的结构成份，并探"国家自然科学基金支助项目（12#3""%%）作者简介：吴建祥（%2#45），男，浙江渚暨人，浙江大学生物技

6、术研究所讲师，硕士，主要从事免疫学和分子生物学研究收稿日期：%2226"46%#，修回日期：$"""6"%6%"$期吴建祥等：稻瘟病菌单克隆抗体的研制及其对稻瘟病菌附着胞形成的影响>?&讨其对附着胞形成的作用，我们首次制备了稻瘟病菌的一系列单克隆抗体。发现单克隆抗体在适当浓度下能有效地封闭病菌表面抗原因子，干扰病菌的附着胞形成，抑制病菌侵染寄主形成病斑。单克隆抗体这一特性为稻瘟病的防治提供了一条新的思路。而且，我们利用单克隆抗体为探针，筛选稻瘟病菌分生孢子的!"#$表达文库，已获得一个与附着胞形成相关的基因，为稻瘟病菌附着胞形成的

7、分子生物学研究打下基础。!材料和方法!%!发芽孢子和附着胞抗原制备稻瘟病菌&’(’’)’由浙江省农业科学院稻瘟病研究室柴荣耀提供，该菌株对籼稻（!"#!$%）品种致病性强。菌种在实验过程中一般在*+,$上培养。通过混合培养产生大量孢子后，用-./01明胶，轻轻地在培养基表面洗擦，收集悬浮液，经羊毛纸过滤后得纯分生孢子。分生孢子悬液经02---3离心0456，收集沉淀孢子，用灭菌的去离子水（+57(7589:;）悬浮稀释至’-<个分生孢子／4=浓度。取该浓度的分子孢子悬液0-，然后用移!=液枪小心逐滴加到洗净灭菌的玻璃培养皿（直径&

8、!4）上，每皿><滴，保持一定距离，注意防止水滴之间相遇连合，/?@培养’-A后，此时不发芽孢子所占比例为0.<1，发芽孢子未形成附着胞比例为>’.?1，发芽孢子已形成附着胞的比例为??.?1。用洗净灭菌的小橡皮轻轻擦刮，收集上述培养皿上的稻瘟病菌