尿道下裂发病机制研究

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1、重庆医科大学博士学位论文尿道下裂发病机制研究姓名：刘星申请学位级别：博士专业：儿科学（小儿外科学）指导教师：魏光辉20090501重庆医科大学博士研究生学位论文尿道下裂发病机制研究摘要背景：尿道下裂(Hypospadias)是d,JL最常见的泌尿生殖道先天畸形。由于阴茎及前尿道发育不全，尿道开口异常伴阴茎下弯畸形，导致患儿不能站立排尿，并影响成年后性功能及生育力。手术矫正畸形是本病的唯一治疗措施，但术后并发症发生率较高，是患儿及家长的心患。为此，有关尿道下裂病因的研究受到学者们关注，以期通过尿道下裂病因学的研究寻找其预防、治疗学突破。尿道下裂发

2、病率约1／200～1／300，而且有逐年增加趋势，大量研究提示其发病率的增加与环境雌激素污染密切相关。邻苯二甲酸二(2．乙基)己酯(DE唧)是一种广泛应用于塑料及化工产业的增塑剂，在医疗工作和日常生活中被大量应用，已构成我国严重的“白色污染”。DEHP进入环境后不易被降解，能蓄积于人体产生雌激素样生物活性。课题组前期研究已发现DEHP可损害实验动物睾丸及附睾功能导致小鼠隐睾畸形，可同时伴有尿道下裂的产生。虽有文献报道DEHP能诱发实验动物的尿道下裂，但是未就其机制深入研究。因此，本课题针对DEHP对外生殖器的毒性损伤，研究其致畸机制，为进一步防

3、治尿道下裂发生提供科学依据。目的：利用DEHP的外生殖器的毒性损伤，诱导胎鼠尿道下裂；体内外观察阴茎发育情况，检测细胞凋亡改变、TGF一131及ATF3等在重庆医科大学博士研究生学位论文阴茎组织中的表达；对比尿道下裂患者与正常儿童包皮TGF．131表达差异，深入探讨尿道下裂发生机制。方法：1．将C57BL／6及KM孕鼠分为对照组与DEHP处理组，DEHP处理组分为100mg／kg·d、200mg／kg·d与500mg／kg·d三个剂量组(DEHPloo，DEHP200，DEHP500)，于妊娠12．5d-17．5d(GDl2．5～17．5)期间

4、灌胃；对照组于同期用0．1mL玉米油灌胃。于GDl9剖腹取出胎鼠，对比观察胎鼠阴茎与尿道发育；尿道橡胶管型重塑胎鼠尿路情况，测量尿道长度；统计尿道下裂发生率。采用整体原位杂交(MSH)技术检测胎鼠阴茎中TGF—plmRNA的表达。2．获取上述各组胎鼠及幼年鼠阴茎，运用免疫荧光、RT-PCR、westernblot技术检测TGF．131与ATF3的表达；经TUNEL染色观察阴茎内细胞凋亡情况，检测凋亡相关蛋白：Bcl．2、Bax及P53的表达。3．取正常GDl2．5胎鼠阴茎体外培养，分别经不同剂量的MEHP、TGF．131细胞因子及MEHP+TG

5、F．131单克隆抗体干预，观察阴茎发育情况，运用RT-PCR对比TGF．131与ATF3基因表达的变化。4．取尿道下裂病人与正常儿童包皮，采用免疫组化、RT-PCR及荧光实时PCR方法检测TGF—p1表达，对比其差异。结果：1．DEHP成功诱导出尿道下裂小鼠动物模型，尿道下裂表现为阴茎体变短、尿道开口异位、包皮分裂，DEHPloo、DEHP200与DEHP500尿道下裂发生率分别为7．1％、14．0％和75．7％；实验组雄性胎鼠体重及肛门尿道口距离(AGD)均值随DEHP剂量增加而逐渐减小(胙O．05)；尿道橡胶管型显示尿道下裂胎鼠尿道变短，尤

6、以前尿道明4重庆医科大学博士研究生学位论文显，中高剂量组尿道长度较对照组明显缩短(肛O．001)；阴茎连续切片显示实验组尿道轴偏向阴茎腹侧，尿道板向腹侧隆起及融合过程落后。WISH检测发现胎鼠阴茎中TGF．131mRNA特异表达于尿道板及尿道上皮。2．RT-PCR、免疫荧光及westernblot均显示在胎鼠阴茎内，TGF．131与ATF3mRNA与蛋白的表达随DEHP剂量的增加而逐渐增强，而在生后20d及40d小鼠阴茎内，TGF．plmRNA的表达显著低于正常对照；阴茎细胞的凋亡减少伴P53表达下降，而Bcl．2／Bax比值无明显变化。3．体

7、外培养条件下胎鼠阴茎能够较好生长，MEHP及TGF一131细胞因子能显著抑制阴茎发育。MEHP不能上调TGF．131及ATF3mRNA的表达，TGF．131细胞因子也不能上调ATF3mRNA的表达，TGF一131抗体不能抑制ATF3mRNA的表达。4．尿道下裂患儿包皮中TGF．131表达具有低于正常儿童趋势。结论：DEHP诱导胎鼠尿道下裂可能与其上调TGF．131及ATF3表达有关，TGF．131及ATF3的异常表达可能是尿道下裂发生机制的关键环节，但TGF一131可能不与ATF3产生信号传导。关键词：尿道下裂，DEHP，MEHP，TGF一13

8、1，ATF3重庆医科大学博士研究生学位论文STUDYONTHEMECHANISMoFHYPOSPADIASABSTRACTBACKGROUND：Hyp