α—半乳糖苷酶发酵工艺、分离纯化及其应用研究

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1、浙江大学生物系统工程与食品科学学院博士学位论文α—半乳糖苷酶发酵工艺、分离纯化及其应用研究姓名：刘彩琴申请学位级别：博士专业：食品科学指导教师：何国庆20070401逝些厶堂擅主翌位迨窒虫室摘要量为107．9KDa。纯化后0【．半乳糖苷酶的三组分最适作用温度均为60℃；(]L一半乳糖苷酶三组分的最适作用pH不同，n—galI和d—galIII的最适反应pH为5．0，Ⅱ．gaIⅡ为4．0；就酸碱稳定性而言，cc_galI在pH4．0的环境中最稳定(酶活保留率达78．9％)，0L—galII在pH6．0的环境中最稳定(酶

2、活保留率达73．7％)，0【．gal111在pH5．0的环境中最稳定(酶活保留率达88．4％)。(6)不同金属离子和糖类等对0【．半乳糖苷酶三组分酶活的影响是不同的：三组分均受A矿强烈抑制，Cu2+对d—galI和0【-g甜III有明显的抑制作用，而对仅一galII有激活作用。ca2’、M92+、K+和Na+对0【-galI酶活的影响不大，Mn2+离子有激活作用；Ca2+、M92中、Zn2+和Mn2+对旺-galII有激活作用，e和Na+有抑制作用：Ca2+、Zn¨和K+对a．galIII酶活的影响不大，Mg”、Mn

3、2+和Na+离子有激活作用。SDS对a一半乳糖苛酶a唱alI和d-galIII有明显的抑制作用，而对q．galII影响较小，EDTA、乳糖、棉籽糖对三组分均有抑制作用，海藻糖、甘露糖、CaCl·2H20和巯基乙醇对a-galI和0【一galII均有抑制作用，而对d—galTII组分几乎无影响。(7)ol—galI对对硝基．旺一D一半乳糖苷的米氏常数Km=9．39mmol／L，对水苏糖的Km=12．79mmol／L，对棉籽糖的Krn=4．79mmol／L，对蜜二糖的Km=1．03mmol／L；c【．galII对对硝基一

4、n—D-半乳糖营的米氏常数Kin=6．54mmol／L，对水苏糖的Km=2．39mmol／L，对棉籽糖的Km=11．38mmol／L，对蜜二糖的Km=2．02mmol／L；c【．gallII肘对硝基．Ⅱ．D一半乳糖苷的米氏常数Krn=8．24mmol／L，对水苏糖的Km=9．98mmol／L，对棉籽糖的Km=4．33mmol／L，对蜜二糖的Kin=3．18mmol／L。(8)甘露醇、海藻糖和棉籽糖对c【一半乳糖苷酶粗酶液热稳定性有较好的保护作用。采用『F交实验设计获得了复合保护剂配方为：1．75mmol／L的海藻糖，

5、1．5mmol／L的甘露醇和2mmol／L的棉籽糖。复合保护剂的添加能使a．半乳糖苷酶在30℃～60。C范围内的酶活保留率提高11．6％～21．7％，28。C存放24h，该酶在试{3．0的环境中保健d52％的活性。u一半乳糖苷酶在28℃、36．2℃和45℃下贮存，酶活损失50％的时间分别为：液体酶对照组51．90、28．13和7．31天；液体酶处理组：97．11、40．685n7．49天，而固体a．半乳糖苷酶损失50％所需时间分别为：88．54、24．475L18．78天。(9)纯化后的Ⅱ-半乳糖苷酶0【一galI、

6、“一galII和0【一galIⅡ均能水解豆粕乳、棉籽粕乳和菜籽粕乳中的水苏糖、棉籽糖等寡糖。a—galI、0【一galII和c【一galIII均能水解豆粕乳中水苏糖和棉籽糖。旺一galII对水苏糖的水解能力大于旺一galI和n—galIII，50。C比40。C更易使豆粕乳中水苏糖游离出。40。C和50。C水浴温度下，反应1～5h，cl—galII对豆粕乳中棉籽糖的水解率达100％；n—galI和a—galIII对棉籽糖的水解能力较弱，50。C比40。C更有利于棉籽糖的生成。cc—galI、旺一galII和a-galⅢ

7、对棉籽粕乳具有水解作用。Ⅱ-galII对水苏糖的水解能力比VI逝迤厶堂壤±堂位丝毫——虫噩擅耍cl-galI、cc-galIII高。c【嘻a111对棉籽糖的水解能力最强，40。C时反应3h，水解率达99．9％。其次是c【一galIII，其对棉籽糖的水解率在40。C时以3h最高，为43．3％，50℃时4h最高，为84．71％。0t-gaII对棉籽糖的水解能力较弱。Ⅱ一galI、o【一galII和0【一galIⅡ对菜籽粕乳有水解作用。其中，Ⅱ-galIⅡ对水苏糖的水解能力最强；在40℃和50。C水浴温度下，水苏糖的水解率

8、为100％。40。C时，u．galH作用3h，而50。C作用2h，水苏糖完全被酶解；u—galI对水苏糖的水解能力较弱，与50℃相比，40。C更不利于水解。40。C时，0l噜alI作用1h，可将棉籽糖几乎完全水解：而0【一galIl和仳一gal111对棉籽糖的水解能力弱。50。C时，三者对棉籽糖的水解能力均很弱。(10)固态发酵法生产的旺一半乳