qRT_PCR_生物分析检测技术

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1、第二节实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR仪、技术原理及应用一、实时荧光定量PCR仪二、实时荧光定量PCR的技术原理1.定量与常规的差别2.荧光扩增曲线3.荧光阈值和CT值4.熔解曲线5.标准曲线6.何为实时？7.SYBRGreenI的工作原理8.MolecularBeacons（发夹型杂交探针）的工作原理9.TaqMan（水解型杂交探针）的工作原理10.多色多通道技术应用——基因表达分析11.内标技术介绍三、实时荧光定量PCR技术的应用介绍1.医疗方面2.研究方面3.其它方面四、荧光定量PCR实验室所需仪器设备清单五、实时定量PCR及应用于植物分子生物学的研究一、实时荧光定量PC

2、R仪热循环仪（PCR仪）荧光检测系统计算机及软件系统不产热的光源---发光二极管（LED）灵敏度高的检测器---光电倍增管（PMT）优点：不产热---无散热装置，全封闭无机械转动装置---抗震性强无需经常校准，耐用灵敏度高线性范围广Opticon实时荧光定量PCR仪荧光检测热循环仪光色:蓝色光均一性:±0.4°C染料:FAM,SYBRGreenI,MolecularbeaconsTaqManProbes精确性:±0.3°C激发光波长：450-495nm发射光波长:515-545nm升降温速率:最高3°C/秒.灵敏度:<5nM的荧光素温度梯度:有检测范围:100-108拷贝容量:96

3、样品反应管:0.2mL反应管&96孔板操作系统:WindowsNT二、实时荧光定量PCR的技术原理1.定量与常规的差别常规PCR技术：对PCR扩增反应的终产物进行定量及定性分析定量PCR技术：对PCR扩增反应中每一个循环的产物进行定量及定性分析SYBRGreenI定量原理确定初始模板的浓度:初始DNA量越多,荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少Log浓度与循环数呈线性关系：根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量实时荧光定量PCR技术简介实时荧光定量PCR技术简介实时荧光定量PCR技术简介实时荧光定量PCR技术简介实时荧光定量PCR：其反应体系中，引入了一种荧

4、光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。2.荧光扩增曲线荧光扩增曲线可以分三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。荧光背景信号阶段：扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。平台期：扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段：PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们

5、可以选择在这个阶段进行定量分析。3.荧光阈值和CT值荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。荧光阈值线的位置一般事实上位于减去本底的位置上，这时的荧光信号超过了荧光背景信号并且开始增加。对某一样品的C（t）值就定义为荧光量与荧光阈值线交叉时的循环数。即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值（thresholdvalue）。定量荧光扩增曲线是荧光量与循环数的图表。4.熔解曲线在PCR结束后，我们可以根据变性过程中的荧光值变化绘出每个样品

6、的熔解曲线。绘制熔解曲线时，Real-TimePCR仪连续监测每个样品在从双链完全配对到完全解链的升温过程中荧光值的变化过程。不同的扩增产物因为其长度和GC含量不同而在不一样的温度下解链，当产物解链时，SYBRGreenⅠ的荧光值将降低并被仪器监测到。由此绘制出荧光强度随温度变化的负一次倒数图。荧光强度变化的拐点（熔点，Tm）即为熔解峰值。熔解曲线是扩增反应的质控途径，当图中没有出现杂峰，也未出现主峰的异常增宽：表明实验中未出现污染、引物二聚体和非特异性扩增。5.标准曲线CT值与起始模板的关系研究表明，每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系：起始拷贝数越多，CT值越

7、小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表CT值，纵坐标代表起始拷贝数的对数（如图3所示）。因些只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。Thistechnologyisverysensitiveinthatitisabletodetectsinglecopiesofgenesandrequiresverylittlestartingmaterialacrossawidespectrumofconditions.Thesys