eminar宋振威英文文献x

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1、Expressionofintein-taggedfusionproteinanditsapplicationsindownstreamprocessing内含肽标签融合蛋白的表达及其在下游工序中的应用Seminar2009-12-172宁夏大学生科院宋振威introduction3宁夏大学生科院宋振威introduction4宁夏大学生科院宋振威引言重组蛋白的纯化目标：减少成本。传统步骤缺点：1.步骤多；2.需要蛋白酶。内含肽改变了遗传信息的传递。步骤：不需要蛋白水解酶参与。新技术门类----内含肽技术。5宁夏大学生科院宋振威两类纯化方案图例6宁夏大学生科院宋振威Or

2、iginoftheterm“intein”anditsstructuralandfunctionalcharactestics7宁夏大学生科院宋振威Originoftheterm“intein”anditsstructuralandfunctionalcharactestics8宁夏大学生科院宋振威内含肽的起源、结构、功能1990年，蛋白自切割生物学事件。嵌入的蛋白质。独立催化蛋白质前提成熟。类似于内含子，但是被转录和翻译，转录后水平的机制。相当于复合酶体。包含两个功能域：双功能（核酸内切酶、自我催化切割）。350~550氨基酸，长至1650个氨基酸。广泛存在于细菌、古

3、细菌、真核生物。DNA代谢功能或途径（合成酶、重组酶、核糖核酸还原酶）序列相似性低，但结构、机制、进化等高度相似。9宁夏大学生科院宋振威内含肽的起源、结构、功能大部分内含肽为可移动的遗传元件，分开同源的等位基因。被认为也是寄生遗传元件。（病原性分支分支杆菌）。序列多变，（基因重排导致）。反式剪切的应用----构建环状分子。10宁夏大学生科院宋振威Mechanismofintein-basedproteinsplicing11宁夏大学生科院宋振威Mechanismofintein-basedproteinsplicing12宁夏大学生科院宋振威内含肽的机制亲核置换反应，四

4、步：1.N-S或N-O转换；2.转酯；3.Asn环化；4.S-N重排，酯键形成肽键。实质是N端的断裂、C介导的断裂和连接。特点：1.只在体内完成；2.Cys,Ser----His-Asn；3.多种残基参与；13宁夏大学生科院宋振威C-端残基：用Asp代替Gln，正调；用Ala代替His，负调。另类的内含肽。N端为电荷中转系统。内含肽的机制14宁夏大学生科院宋振威Characteristicsandadvantagesofintein-taggedexpressionsystem15宁夏大学生科院宋振威Characteristicsandadvantagesofintei

5、n-taggedexpressionsystem16宁夏大学生科院宋振威Characteristicsandadvantagesofintein-taggedexpressionsystem17宁夏大学生科院宋振威内含肽标签表达系统的特点1997年，NEB商品化系统。传统亲和标签去除需要酶的催化：1.酶不一定总是特异的；2.温度可能影响到蛋白的结构和活性；3.需要去除酶和标签的步骤。内含肽介导的纯化系统：1.不需要酶—简化步骤、节约成本；2.裂解反应可以原地发生在柱上—一步实现；3.温度、Ph诱导发生反应可以进一步简化、节约；18宁夏大学生科院宋振威IMPACT1.N，

6、C端均可融合目的蛋白，方便蛋白的优化表达和折叠；2.PH、温度诱导，防止硫醇类试剂对N端裂解的影响；3.可以不用在目的蛋白前加Met；4.如果目的蛋白N端存在Cys，N端的融合策略是必要的；内含肽标签表达系统的特点19宁夏大学生科院宋振威1.C端的序列较为主导；Met、Tyl、Phe较好；Asp、Pro、Gly、Ala降低切割效率；2.N端Cys-Arg、Gly-Arg、Ser-Arg较好；Pro不佳；3.C端的优于N端融合。综合考虑，优化构象，裂解条件。内含肽标签表达系统的特点20宁夏大学生科院宋振威Applicationofintein-taggedaffinity

7、sysytemtotargetproteinpurification21宁夏大学生科院宋振威Applicationofintein-taggedaffinitysysytemtotargetproteinpurification22宁夏大学生科院宋振威Applicationofintein-taggedaffinitysysytemtotargetproteinpurification23宁夏大学生科院宋振威酿酒酵母胞液ATPase亚单位A，Ｃ端Asn454代替了Ala;基本步骤（上柱、诱导、洗脱、透析、检测）。得率、活性、产量；IMPA