基于纳米金胶和磁性纳米颗粒的DNA和凝血酶蛋白质电化学检测的研究

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1、华东师范大学博士学位论文基于纳米金胶和磁性纳米颗粒的DNA和凝血酶蛋白质电化学检测的研究姓名：郑静申请学位级别：博士专业：分析化学指导教师：何品刚;方禹之20070501途径，纳米粒子的独特性能为生物检测奠定了基础，其和核酸适体的高度特异性，电化学方法的高灵敏性相结合，使得检测的灵敏度大大提高，使其应用范围更加广阔，将为生物分析化学开辟新的领域。本论文的目的就是研究基于纳米颗粒的新型电化学检测方法。利用纳米金的优异的电化学性能和纳米磁性颗粒的顺磁性，设计了几种新型的电化学DNA和凝血酶蛋白质检测方法，拓宽了后基因时代的研究领域，论文主要内容如下：第一章绪论首先介绍了DNA生

2、物传感器和核酸适体生物传感器的原理、应用及其研究进展，其中着重介绍了电化学的DNA生物传感器的原理和研究进展，重点介绍了核酸适体生物传感器的原理和应用，对今后的发展方向和趋势进行了展望。接着介绍了纳米材料在分析化学中的应用．最后阐述了本论文的目的和意义。第二章基于核酸适体和纳米材料的凝血酶蛋白电化学特异性识别的研究本文介绍了一种结合核酸适体技术和纳米技术，以凝血酶蛋白为研究对象的高效、高灵敏、特异性识别蛋白质的电化学方法。利用金纳米颗粒标记的核酸适体以及被固定在磁性纳米颗粒上的核酸适体与凝血酶蛋白同时结合形成磁性颗粒／凝血酶／纳米金胶的三明治结构，利用磁性分离，将金胶纳米颗

3、粒特异性地吸着到电极表面，通过检测电极上金胶的电化学信号，实现对凝血酶靶蛋白的检测。该方法对凝血酶蛋白具有很高的特异性识别能力，其检测不受其他蛋白质如牛血清白蛋白等存在的干扰，可应用于实际血浆中凝血酶的检测．由于利用磁性纳米颗粒使得分离、富集和测定在同一个自制的电化学反应池中进行，其操作不仅简单，而且检测的灵敏度得到提高。该蛋白质检测的线性范围为5．6X10。2mol／L～1．12X10。9mol／L，检测限可以达到1．42X1012mol／L。该方法对凝血酶蛋白有很好的特异性，其他蛋白如溶菌酶和牛血清白蛋白的存在对于检测没有影响。第三章利用互补核酸杂交富集金胶实现信号扩增

4、的凝血酶蛋白质的特异性电化学检测研究在本文中，介绍了一种利用互补核酸杂交富集金胶实现信号扩增的特异性蛋白检测研究。以凝血酶蛋白为研究对象，利用凝血酶蛋白相对应的二段核酸适体，适体I固定在磁性颗粒上用于特异性地捕获蛋白，适体II标记金胶作为检测信标。由凝血酶蛋白和相对应的二段核酸适体构建三明治结构的特异性识别凝血酶的蛋白检测方法。另外，再通过信标金胶上过剩的核酸适体链与另一段标记有金胶的互补核酸进一步杂交，获得金胶的选择性聚集，实现信号扩增。通过信号扩增，此传感器的灵敏度大大提高，对凝血酶蛋白的检测下限可以达到4．52×1015mol／L．平行测定浓度为7．47X10-“mo

5、l／L的凝血酶八次，其RSD为3．0％。第四章基于硫代三聚氢酸和金纳米颗粒形成网状结构实现信号扩增的超灵敏凝血酶蛋白质电化学检测的研究在本文中，介绍了一种利用金纳米颗粒和硫代三聚氢酸来实现信号扩增的超灵敏度和高度特异性的蛋白质的电化学检测方法．以凝血酶蛋白为研究对象，由凝血酶蛋白和相对应的二段核酸适体构建三明治结构的凝血酶蛋白特异性检测方法的基础上，再通过硫代三聚氢酸和金纳米颗粒的自组装作用，形成金纳米颗粒和硫代三聚氢酸的网状结构，获得金纳米颗粒的选择性聚集，实现信号扩增。通过信号扩增，该方法的灵敏度大大提高，对凝血酶蛋白的检测下限可以达到7．82amol／L。该电化学检测

6、方法对凝血酶蛋白有很好的特异性，其他蛋白如溶菌酶和牛血清白蛋白对于检测没有影响。可望用于其他蛋白的检测，疾病的诊断和其他的生物研究领域。第五章基于金纳米颗粒选择性聚集实现信号扩增特异性电化学检测p53基因的研究在本文中，介绍了一种利用金纳米颗粒的聚集实现信号放大作用的超灵敏和高度特异性的电化学方法用于人类p53肿瘤抑制剂基因研究。在实验中，根据p53基因的序列设计并合成了能特异性检测p53肿瘤抑制剂基因的二段探针，在一段探针上固定磁性颗粒以捕获并富集目标DNA，在另一段探针上标记金纳米颗粒作为检测信标。另外，再通过硫代三聚氢酸和金纳米颗粒的自组装作用，形成金纳米颗粒和硫代三

7、聚氢酸的网状结构，获得金纳米颗粒的选择性聚集，实现信号扩增。用此法检测得到的目标野生型DNA，最低检测限为2．24×i0～7mol／L。在同样浓度的条件下，单碱基错配的突变型序列和完全互补的野生型序列的区分度为57．1％。第六章基于纳米金胶和磁性纳米颗粒和利用取代反应电化学特异性识别凝血酶蛋白质的研究本文介绍了一种基于取代反应的特异性识别凝血酶的电化学方法。利用金胶标记的互补核酸和固定在磁性纳米颗粒上的核酸适体的杂交，形成双链的核酸适体／互补核酸，在凝血酶蛋白的存在下，核酸适体与凝血酶蛋白特异性的结合，形成G．四分