ch6-细胞重组与克隆动物

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1、细胞重组与克隆动物第六章一.细胞重组二.细胞核移植三.克隆动物一、细胞重组1.细胞拆合☉细胞拆合即细胞组分的分离与融合，是指将细胞分为核和质两部分，还包括微细胞的诱导和中期染色体的分离。☉诱导核质分离和产生微细胞需用特殊的试剂——松胞素B。松胞素B又称细胞松弛素B(cytochalasinB,CB)。是一种真菌的代谢产物。1967年发现CB可以诱导离体培养的小鼠L细胞去核。2.细胞组分的分离☉胞质体（cytoplast）指去核后的细胞。能保持细胞的原形，具有除核以外的细胞器，不能合成DNA和RNA，但能合成蛋白质。☉核体（karyopl

2、ast）或称小细胞（minicells），指细胞分离出来的核。外包有质膜和少量细胞质，在一段时间内能合成DNA和RNA。☉微细胞（micocells）秋水仙素将细胞分裂阻滞在中期，细胞不能分裂，一条或几条染色体组装成为微核，再用松胞素处理，微核突出细胞膜外，可获得微细胞。3.细胞重组方式☉细胞质杂种(cybrib)——由胞质体与完整细胞融合而成。胞质体——带有氯霉素抗性（CAPR）的小鼠L细胞的胞质体。完整细胞——对氯霉素敏感（CAPS）、但具有BudR抗性（BudRR）的小鼠L细胞亚系。胞质杂种——可以在具有氯霉素和BudR的培养基中

3、存活。图6-1胞质杂种的产生☉微细胞异核体(micocellheterokaryons)——由微细胞与完整细胞融合而成。微细胞只含有单个或几个染色体，是进行遗传物质转移的适宜工具。微细胞异核体经分裂也是体细胞杂种，是研究基因定位、基因表达的好材料。图6-2微细胞的形成（一）图6-3微细胞的形成（二）☉重组细胞(reconstitutedcell)——用一种细胞的胞质体与另一种细胞的核体融合而产生。重组细胞的鉴定方法：¤放射性同位素标记法用3H-TdR标记细胞核供体，用3H-Leu标记细胞质供体。融合细胞作放射自显影，如果胞质和胞核都

4、有放射性银颗粒，而核的颗粒大而深、胞质银粒较细，即为重组细胞。图6-4同位素标记法鉴定重组细胞¤综合标记法用大乳胶颗粒标记胞供体（HPRT-）,去核后得胞质体（去核细胞）；用小乳胶颗粒标记核供（HPRT＋）,得小细胞（核体）；胞质体（大乳胶颗粒）与小细胞融合成重组细胞；胞质体（大乳胶颗粒）与核供体细胞（小乳胶颗粒、HPRT＋）融合成胞质杂种。图6-5重组细胞与胞质杂种的鉴别二、细胞核移植在细胞重组的几种方式中，胞质体与核体的重组，即核移植技术(nucleartransplantation)最令人关注。1.鱼类和两栖类的核移植☉1938年

5、，德国胚胎学家汉斯.施佩曼（HausSpeman）提出：“在两栖动物中，8细胞以前的胚胎具有发育的全能性”的观点。并提出奇异的设想：把一个细胞的细胞核取出，然后把取自另一个发育到后期的胚胎的细胞核放入这个卵细胞中。☉1952年，美国学者罗伯特.布里格斯（RobertBriggs）等，将豹蛙发育到囊胚期的胚胎细胞做移植试验，成功获得可摄食的豹蛙幼体。☉1958年，英国学者约翰.格登(JohnGurdon)等，利用爪蟾原肠内胚层细胞核移植，培养出可育的爪蟾。☉1961年，我国学者童第周等进行鱼类不同亚科间细胞核移植获得成功。表6-1移核后卵

6、子发育的实验☉1978年，童第周等将黑斑蛙成体红细胞的细胞核移入去核的未受精卵内，卵子正常发育成蝌蚪（红细胞这样高度分化的细胞，在特殊条件下，也可重新表达）。☉1979年，武汉水生所，将鲫鱼囊胚期细胞经过385天59世代连续继代培养后，再将此培养细胞的细胞核移植到同种鲫鱼的未受精卵中。1984年，培养出两尾无性繁殖的幼鱼，其中一条发育正常，80多天长到8cm。☉1989年，童第周等将鲫鱼胚胎细胞核移入去核的未受精卵中，实现了不同种间的核质杂交，无性繁殖出“鲤鲫核鱼”。2.哺乳类的细胞核移植两栖类实验材料具有卵数量多、容易取得、体积较大、

7、操作方便等优点，而哺乳动物的卵细胞直径小，鼠卵直径为100μm、兔卵125μm、牛卵140μm、人卵100μm。核移植需在显微操作仪(micromanipulator)下进行。☉1977年，美国杰克逊实验室的“亚无性繁殖”实验（1）受精卵在精、卵核融合前把精核去掉，放入松胞素溶液中；（2）上述处理后卵细胞染色体的复制出现两个核，将此双核卵放入正常的培养基中培养；（3）卵中双核自动融合，并开始细胞分裂；（4）将此胚胎移入母鼠子宫培养；（5）生产出7只单亲小鼠。☉1981年，瑞士的卡尔.伊尔门泽(K.Illmensee)等首次获得小

8、鼠卵核移植成功。他们将囊胚内细胞团的核移入去核的受精卵中，经培养，移植卵发育至囊胚期，再将此胚胎植入同步孕鼠的子宫内，产下两雌一雄小鼠。（1）纯系(LT/SV或CBA/HT-6)灰色小鼠作核供体亲本；（