(临床医学)膜片钳技术与离子通道药理学

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1、（Patchclamptechniques&Ionchannelpharmacology）膜片钳技术与离子通道药理学马腾飞药理教研室1991Nobel基金会的颁奖评语：膜片钳技术点燃了细胞和分子水平的生理学研究的革命之火，为细胞生理学的研究带来了一场革命性的变化，它和基因克隆技术并驾齐驱，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。1、细胞电生理学3、离子通道药理学2、膜片钳技术及其应用OUTLINE细胞电生理学Electrophysiology细胞电生理学：揭示细胞的生理过程，用电生理方法记录生物电活动测量离子、离子通道细胞兴奋生物电信号细胞电生理学

2、膜的“流动镶嵌模型”细胞膜和离子学说建立（Hodgkin，etal.1946年）1、生物膜分子结构？2、物质转运功能？脂质双分子层、蛋白质、糖类单存扩散、易化扩散、主动转运、出入胞离子通道(ionchannels)离子通道是细胞膜上的一种特殊整合蛋白，对某些离子（K+、Na+、Ca2+等）能选择通透，其功能是细胞生物电活动的基础。一、离子选择性(selectivity)（大小和电荷）：某一种离子只能通过与其相应的通道跨膜扩散(安静：K>Na100倍、兴奋：Na>K10-20倍）；各离子通道在不同状态下，对相应离子的通透性不同。二、门控特性(Ga

3、ting)：失活状态不仅是通道处于关闭状态，而且只有在经过一个额外刺激使通道从失活关闭状态进入静息关闭状态后，通道才能再度接受外界刺激而激活开放。开放状态openstate失活状态Inactivestate静息状态restingstate激活activation失活inactivation复活recovery离子通道的特性(CharacteristicofIonChannels)配体门控通道阳离子通道：乙酰胆碱、谷氨酸、五羟色胺受体阴离子通道：甘氨酸和γ－氨基丁酸受体通道蛋白——离子通道乙酰胆碱受体电压门控通道：钾、钠、钙离子通道通道蛋白——离

4、子通道电压门控钾离子通道研究技术Patch-clamp技术新药开发Na+,Ca2+,K+,Cl-等电流分子生物学技术单细胞电流记录离子通道的结构与功能药物作用机制基因克隆及蛋白表达通道蛋白功能测定1、细胞电生理学3、离子通道药理学2、膜片钳技术及其应用OUTLINEPatch-clamp(膜片钳)技术探头计算机模数转换膜片钳放大器样品池单细胞K+Ca2+Na+++-电极电极--基本原理利用负反馈电子线路,将微电极尖端所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜的电位固定在一定水平上,对通过通道的微小离子电流作动态或静态观察,从而研究其功能。膜片钳实验室基

5、本设备膜片钳放大器信号转换器倒置显微镜微操纵器防震工作台及静电屏蔽笼微电极拉制仪及抛光仪计算机专用软件细胞记录槽恒速灌流泵Electrophysiology-ApparatusFaradaycageVibrationIsolationTableMicroscopeMicro-ManipulatorsRemoteControllerAmplifiersCCDCameraElectrophysiology-ApparatusMicro-ManipulatorsDAD-VCsystemCCDCameraElectrophysiology-Appara

6、tusElectrophysiology-ApparatusPatchclamp膜片钳记录的基本步骤可概括为4大部分：1.液体配制。主要根据研究通道的不同，配制相应的液体，基本原则是保持2个平衡：渗透压平衡和酸碱平衡。2.标本的制备。膜片钳记录标本的制备主要有：急性分离、细胞培养、脑片或其它组织薄片。当根据不同的研究要求而相应选择。3.膜片钳记录4.资料分析用相应的计算机软件进行膜片钳记录电极拉制：一般采用常规二步法完成，电极尖端直径在0.5-2.0μm之间，是否涂胶与抛光应根据经验而定，不必强求。亿欧姆封接：电极充灌安装后即给持续正压，在倒置

7、显微镜监视下将电极贴近细胞，以微操纵器将电极贴于细胞，去掉正压后再稍施负压吸引，亿欧姆封接便瞬间形成。要保证亿欧姆封接就必须做到：1)电极电阻适当；2)电极尖端清洁；3)电极气路通畅；4)电极与细胞相贴宁不及而勿过之；5)细胞膜清洁，活性好。资料分析一般电学性质：通过I/V关系计算单通道电导，观察通道有无整流。通过离子选择性、翻转电位或其它通道激活条件初步确定通道类型。通道动力学分析：开放时间、开放概率、关闭时间、通道的时间依赖性失活、开放与关闭类型(簇状猝发，Burst)样开放与闪动样短暂关闭(flickering)，化学门控性通道的开、关速

8、率常数等。药理学研究：研究的药物，阻断剂、激动剂或其它调制因素对通道活动的影响情况。综合分析得出最后结沦．膜片钳技术的优点膜片钳技术实现了小片膜的孤立