[基础医学]核酸疫苗及免疫研究进展

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1、核酸疫苗LOGODiagram4核酸疫苗定义1235核酸疫苗的发展史核酸疫苗的作用原理核酸疫苗的构建核酸疫苗的优缺点和应用现状疫苗是将病原微生物（如细菌、立克次氏体、病毒等）及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。人们将多种灭活或减毒疫苗称为第一代疫苗。将用基因工程的方法研制的亚单位疫苗称为第二代疫苗。理想疫苗应具备的特征有：安全、廉价、热稳定性好，含有多种具有保护作用的免疫原，最好是一次口服即可生效。目前前两代均不能满足上述标准。故基因疫苗应运而生。基因疫苗被称为第三代疫苗。1990年wolff等从事于基因治疗工作时，用外源性重组质粒给小鼠肌肉

2、注射后，质粒被摄取并能在体内至少两个月稳定地表达所编码蛋白。1991年Williams等发现外源基因输入体内的表达产物可诱导产生免疫应答。1992年Tang等将表达人生长激素的基因质粒DNA导入小鼠皮内，小鼠产生特异性抗体，从而提出了基因免疫的概念。1993年Ulmer等将注射技术用于研究流感核酸疫苗，证实核酸注射不但能在体内表达抗原蛋白，还可以诱导具有显著保护作用的免疫应答。因此，1994年在日内瓦召开的专题会议上将这种疫苗定名为核酸疫苗。关于核酸免疫的国际会议1994年5月17-18日，瑞士日内瓦。WHO主办。主题：核酸疫苗。1995年2月16-17日，美国马里兰州，Bethesda（NI

3、H）。主题：基因疫苗和核酸疫苗战略。1995年4月6-9日，美国弗吉尼亚州。主题：DNA疫苗：疫苗学的新时代。1996年2月5-8日，美国马里兰州NIHNatcher会议中心。主题：核酸疫苗预防传染性疾病和控制核酸疫苗。定义核酸疫苗(nucleicacidvaccine),也称基因疫苗(geneticvaccine),是指一类将抗原基因重组到表达载体上的重组质粒疫苗，经肌肉注射或黏膜免疫等方法导入宿主体内，通过宿主细胞表达抗原蛋白，诱导宿主细胞产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。基因疫苗的构建基因疫苗构建的基本途径基因疫苗的构建一、构建基因疫苗的载体载体是将抗原基因导入到机

4、体细胞的必要工具。1.载体的分类按照载体功能可分为克隆载体和表达载体；按照载体来源可分为质粒、噬菌体、黏粒和病毒载体等。2.常用于构建基因疫苗的载体pcDNA3.1、pcDNA3.1-E、pcDNA3.1/Zeo（+/-）、pcDNA4、pcDNA4/HisMAX、pBudCE4、pRc/RSV、pRc/CMV2等多种基因疫苗的构建二、基因疫苗的构建方法1.抗原基因和载体的制备获得需要的目的基因常用的方法：（1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)，从中调用目的基因；（2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段，建立cDNA文库；（3）利

5、用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段，等等。（4）化学合成基因疫苗的构建基因表达载体的组成：复制原点+启动子+目的基因+终止子+标记基因为了保证抗原基因的定向正确插入，只有以正确的方向插入表达载体读框启动子下游才能表达抗原基因，故抗原基因两端应具有不同的酶切位点，在设计时须注意这点。2.抗原基因与载体的连接连接的方式可分为粘性末端连接和平末端连接两种，其中前者连接效率较高，使用比较多。连接反应时应考虑反应体积、抗原基因与载体的比例、温度和时间和酶量。粘性末端连接用同一种或两种限制性内切酶酶切DNA连接酶重组质粒质粒目的基因本法适用于在质粒和目的基因上有相同单或双酶切位点平

6、末端连接质粒产生平末端的内切酶DNA连接酶产生粘性末端的内切酶核酸酶S1目的基因重组质粒产生粘性末端的内切酶核酸酶S1本法适用于在质粒和目的基因上没有相同的酶切位点！基因疫苗的构建3.重组质粒转化受体菌转化：将质粒或者以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。转染：将质粒或者以它为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。感受态：细菌经过CaCl2溶液处理和短暂热激后，容易摄入外源DNA，这种状态称为感受态。其原理是细菌处于0℃、低渗CaCl2溶液中时，细胞壁和细胞膜通透性增加。此时转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经短暂的热激（42℃）处理后，外源基因容易进入细菌

7、细胞内。常用的方法为氯化钙共沉淀法和电穿孔法。基因疫苗的构建4.重组质粒的筛选与鉴定一般重组质粒鉴定主要按照表型筛选、酶切鉴定和测序鉴定的顺序进行（1）插入片段鉴定：酶切鉴定；PCR鉴定。（2）插入片段方向性鉴定：可利用联合酶切方案进行目的基因的插入方向鉴定。（3）DNA序列测定：末端终止法测序；自动测序仪测序基因疫苗的构建三、重组质粒在真核细胞中的表达与检测1.重组质粒导入真核细胞的方法磷酸钙共