垂直板聚丙烯酰胺凝胶连续电泳分离乳酸脱氢酶同工酶

《垂直板聚丙烯酰胺凝胶连续电泳分离乳酸脱氢酶同工酶》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、垂直板聚丙烯酰胺凝胶连续电泳分离乳酸脱氢酶同工酶（活性染色鉴定法）1实验原理关于垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳关于连续系统和不连续系统关于乳酸脱氢酶同工酶及酶活性染色2垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极方向移动，这种现象称之为电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(Bis)在催化剂过硫酸铵(AP)和加速剂N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶，通过改变凝胶浓度及交联度来调节凝胶的孔径，具有良好的分子筛效应。它已成为目前生化实验室最常用的支持介质

2、。以它为支持物发展起来的各种聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，不仅能分离、小量制备生物大分子，而且可以用来研究生物大分子的性质如电荷、相对分子质量、等电点以及构象等。垂直板电泳将配制好的凝胶溶液注入到两块垂直放置的玻璃板之间聚胶，然后加样进行电泳。3AP-TMTED催化体系TEMED催化AP生成硫酸自由基：S2O82－2SO4·¯硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链：Bis将单体长链间连成网状结构：45化学聚合的凝胶孔径较小，常用于制备分离胶，重复性好。聚合反应受各种因素的影响：•催化剂和加速剂的浓度应选择合适的AP和TEMED浓度使聚合时间控制在30—60min

3、内较好，过量的催化剂和加速剂会引起烧胶和蛋白质条带的畸变。•pHTEMED只能以游离碱的形式发挥作用，在酸性条件下，叔胺缺少自由碱基，引发AP产生自由基的过程会被延迟，聚合时间延长。•温度聚合速度与温度有关，一般是高温聚合快，而聚合的速度影响交联孔径的大小，所以凝胶聚合时必须保持温度恒定，通常用与电泳相同的温度。•分子氧分子氧的存在会阻止碳链的延长，妨碍聚合作用，在聚合过程中要尽量避免接触空气。•杂质某些金属离子或其它杂质也会影响凝胶的化学聚合，所以应选择高纯度的Acr、Bis和AP。6凝胶总浓度及交联度对凝胶的影响凝胶溶液中单体和交联剂的总浓度和两者的比例是决定

4、聚丙烯酰胺凝胶特性包括其机械性能、弹性、透明度、粘着度及孔径大小的主要因素。T为凝胶溶液中单体和交联剂的总质量浓度，C为凝胶溶液中交联剂占单体和交联剂总量的质量分数。式中，a为丙烯酰胺单体的质量(g)，b为交联剂的质量(g)，m为溶液的终体积(mL)。凝胶a、b的比例决定了凝胶的物理性状。当a:b小于10时，凝胶脆且硬，不透明，呈乳白色；当a:b大于100时，即使用5%的丙烯酰胺凝胶也呈糊状；通常用a:b在30左右，并且丙烯酰胺浓度高于3%，凝胶富有弹性并且透明。7凝胶的总质量浓度T和交联度C决定凝胶的有效孔径。凝胶的三维网状结构具有分子筛效应，不同大小和形状的大

5、分子通过孔径时所受的阻滞力不同，加上大分子的电荷效应，使各种大分子迁移率不同得以分离。在实际工作中，常依据待分离蛋白质已知相对分子质量的大小来选择所合适的凝胶浓度，使蛋白质混合物得到最大限度的分离，大多数蛋白质在7.5%凝胶中能得到满意的结果，所以这个浓度的凝胶称为标准胶。当分析一个未知样品时，常用标准胶或梯度凝胶来测试，而后确定适宜的凝胶浓度。8净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳是对天然状态生物大分子进行的电泳，目的是为了保持蛋白质的天然构象、其亚基之间的相互作用及其生物学活性。利用蛋白质分子中所带净电荷、分子质量、形状的差异，在

6、电场中泳动的速度和方向不同，从而达到分离的目的。多数蛋白质的pI在中性偏酸性范围，通常是将样品在碱性缓冲系统中进行电泳，蛋白质分子带负电荷，以不同速度向阳极迁移，称为阳极电泳；对于一些碱性蛋白，使用酸性缓冲系统进行电泳，蛋白质分子带正电荷而向阴极迁移，称为阴极电泳。9蛋白质在净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分离因素电荷因素蛋白质分子形状和大小相同，所带电荷性质和数量不同分子大小蛋白质分子形状和所带电荷性质和数量相同，分子大小不同分子形状蛋白质分子所带电荷性质和数量相同，分子形状不同电荷因素分子大小分子形状10聚丙烯酰胺凝胶电泳的类型连续系统是指电泳系统采用相同孔径的

7、凝胶、缓冲系统等条件下进行区带电泳，是利用蛋白质分子的电荷效应进行分离，凝胶的分子筛效应不明显，一般只用于分离一些比较简单的样品，缺点是分辨率不高。优点是制胶简单快捷，缓冲系统的pH恒定，可以防止样品进胶后因pH变化发生凝聚和沉淀，缓冲系统组成简单。11不连续系统是指使用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系的电泳方式，在电泳分离过程中，由于浓缩胶的堆积作用，可使样品在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带，对样品进行浓缩，然后在一定浓度或浓度梯度的凝胶上进行分离，既存在电荷效应，也有分子筛效应。虽然制胶操作难度较大，但是它具有连续系统不可比拟的优越性，分辨率高。不连续电泳的

8、四个不连续