第二十一章 基因诊断与基因治疗

《第二十一章 基因诊断与基因治疗》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、第二十一章基因诊断与基因治疗基因诊断与基因治疗能够在比较短的时间从理论设想变为现实，主要是由于分子生物学的理论及技术方法，特别是重组DNA技术的迅速发展，使人们可以在实验室构建各种载体、克隆及分析目标基因。所以对疾病能够深入至分子水平的研究，并已取得了重大的进展。因此在20世纪70年代末诞生了基因诊断(genediagnosis)；随后于1990年美国实施了第一个基因治疗(genetherapy)的临床试验方案。可见，基因诊断和基因治疗是现代分子生物学的理论和技术与医学相结合的范例。第一节基因诊断一.基因诊断的含义传统对疾病的诊断主要是以疾病的表型改变为依据，如患者的症

2、状、血尿各项指标的变化，或物理检查的异常结果，然而表型的改变在许多情况下不是特异的，而且是在疾病发生的一定时间后才出现，因此常不能及时作出明确的诊断。现知各种表型的改变是由基因异常造成的，也就是说基因的改变是引起疾病的根本原因。基因诊断是指采用分子生物学的技术方法来分析受检者的某一特定基因的结构（DNA水平）或功能（RNA水平）是否异常，以此来对相应的疾病进行诊断。基因诊断有时也称为分子诊断或DNA诊断(DNAdiagnosis)。基因诊断是病因的诊断，既特异又灵敏，可以揭示尚未出现症状时与疾病相关的基因状态，从而可以对表型正常的携带者及某种疾病的易感者作出诊断和预测，

3、特别对确定有遗传疾病家族史的个体或产前的胎儿是否携带致病基因的检测具有指导意义。二.基因诊断的原理及方法（一）基因诊断的原理疾病的发生不仅与基因结构的变异有关，而且与其表达功能异常有关。基因诊断的基本原理就是检测相关基因的结构及其表达功能特别是RNA产物是否正常。由于DNA的突变、缺失、插入、倒位和基因融合等均可造成相关基因结构变异，因此，可以直接检测上述的变化或利用连锁方法进行分析，这就是DNA诊断。对表达产物mRNA质和量变化的分析为RNA诊断(RNAdiagnosis)。（二）基因诊断的方法15www.medkaoyan.net医学考研网基因诊断是以核酸分子杂交(

4、nucleicacidmolecularhybridization)和聚合酶链反应（PCR）为核心发展起来的多种方法，同时配合DNA序列分析，近年新兴的基因芯片可能会发展成为一种很有用的基因诊断方法。1.DNA诊断常用检测致病基因结构异常的方法有下列几种。⑴斑点杂交：根据待测DNA样本与标记的DNA探针杂交的图谱，可以判断目标基因或相关的DNA片段是否存在，根据杂交点的强度可以了解待测基因的数量。⑵等位基因特异的寡核苷酸探针（allele-specificoligonucleotideprobe,ASOprobe）杂交：是一种检测基因点突变的方法，根据点突变位点上下游核

5、苷酸序列，人工合成约19个核苷酸长度的片段，突变的碱基位于当中，经放射性核素或地高辛标记后可作为探针，在严格杂交条件下，只有该点突变的DNA样本，才出现杂交点，即使只有一个碱基不配对，也不可能形成杂交点。一般尚合成正常基因同一序列，同一大小的寡核苷酸片段作为正常探针。如果受检的DNA样本只能与突变ASO探针，不与正常ASO探针杂交，说明受检二条染色体上的基因都发生这种突变，为突变纯合子；如果既能与突变ASO探针又能与正常ASO探针杂交，说明一条染色体上的基因发生突变，另一条染色体上为正常基因，为这种突变基因的杂合子；如果只能与正常ASO探针杂交，不能与突变ASO杂交，说

6、明受检者不存在该种突变基因，如图21-1所示。若与PCR方法联合应用，即PCR/ASO探针杂交法(PCR/ASOprobehybridization)，是一种检测基因点突变的简便方法，先用PCR方法扩增突变点上下游的序列，扩增产物再与ASO探针杂交，可明确诊断突变的纯合子和杂合子。此法对一些已知突变类型的遗传病，如地中海贫血、苯丙酮尿症等纯合子和杂合子的诊断很方便。也可分析癌基因如H-ras和抑癌基因如p53的点突变。⑶单链构象多态性（singlestrandconformationpolymorphism,SSCP）15www.medkaoyan.net医学考研网分析

7、相同长度的单链DNA因其序列不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不尽相同，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时速度就不同，若单链DNA用放射性核素标记，显影后即可区分电泳条带。一般先设计引物对突变点所在外显子进行扩增，PCR产物经变性成单链后进行电泳分析。PCR/SSCP方法，能快速、灵敏、有效地检测DNA突变点，如图21-2，此法可用检测点突变的遗传疾病，如苯丙酮尿症、血友病等，以及点突变的癌基因和抑癌基因。⑷　限制性内切酶图谱（restrictionmap）分析，如果DNA突变后改变了某一核酸限制性内切酶的识别位点，使原来某一识别位点消失，或